分子垂釣是一種從復雜樣品體系中尋找與已知生物分子相互作用的特定分子（如小分子、蛋白質、或其他生物活性分子）的實驗技術，在生物學研究、中藥研究、活性藥物發現等領域中發揮重要的作用。

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術是一種生物傳感分析技術，可用于研究活性分子與靶點的相互作用，具有靈敏度高、特異性強、分辨率高、樣品消耗少、實時監測等特點。在高通量藥物篩選、候選藥物親和力測定、抗原表位鑒定等生物醫藥領域應用廣泛。近年來，基于SPR的分子垂釣技術越來越引起廣大科研工作者的興趣，該技術利用SPR的高靈敏度、高特異性等特點，以及SPR儀器的實時監測、自動化進樣和回收流程，并結合高分辨質譜鑒定，不僅能用于從細胞裂解液中垂釣蛋白質等生物大分子，也能用于從中藥提取液中垂釣小分子化合物。

一、基本原理和方法 

基于SPR的中藥小分子垂釣的基本原理是將一種已知生物分子（靶蛋白）偶聯在傳感芯片表面，再將包含潛在活性分子的復雜樣品溶液（中藥提取液）注入到傳感芯片，進行SPR檢測和活性分子回收。在進樣過程中，復雜樣品溶液中的活性分子會和偶聯在傳感芯片上的生物分子發生結合，這種結合可能是特異性或非特異性，致使芯片表面物質的質量發生變化進樣結束后，繼續注入緩沖液使未結合或弱結合的成分離開芯片表面，而強結合的成分留在芯片表面。接下來，為了避免管路中的復雜樣品溶液混入后續回收的結合成分中，通過注入洗滌液清洗從樣品到芯片表面之間的管路，去除管路中的復雜樣品溶液。然后再注入洗脫液并孵育適當時間，使芯片表面上結合的小分子解離下來。最后將液體流向反轉，使解離下來的樣品原路返回并收集在樣品溶解液中。由于一次僅可回收微量樣品（2μL），可多次循環上述過程（一般10-20次），回收足夠量的樣品，合并后濃縮，用于后續質譜鑒定，最終發現復雜樣品中的活性分子。圖1  基于SPR的分子垂釣的基本流程

二、垂釣實驗經驗和技巧 

理解基于SPR的分子垂釣的原理是實驗成功的第一步，在實際操作中還需要特別關注以下方面，這些將直接影響結果的準確性和可靠性。

1．靶蛋白的偶聯量 為了盡可能多回收活性成分，靶蛋白的高偶聯量是至關重要的。一般首選CM5傳感芯片通過-COOH與蛋白的-NH2發生反應，偶聯效率較高，偶聯水平可到達10000-20000 RU。對于不易提取純化的跨膜蛋白，可選用L1 傳感芯片，其表面可捕獲囊泡和脂質體。另外還有SA傳感芯片，其表面固定了鏈酶親和素，可特異性偶聯帶有生物素標記的蛋白、多肽、核酸等。

2．靶蛋白的活性和特異性 在垂釣實驗前應驗證偶聯后靶蛋白的活性和特異性，這一驗證實驗可以通過對特異性抗體/抗原或已知的活性分子進行親和力測定，以確認傳感芯片上靶蛋白的結合活性，有助于提高垂釣結果的準確性和可靠性。

3．緩沖液的組成 在復雜樣品的“進樣-回收”過程中，應注意維持適當的緩沖液條件，以提高回收效率。運行緩沖液和樣品稀釋液一般為PBS或EP；樣品回收液一般為弱酸（三氟醋酸、甲酸、乙酸）、弱堿（NaOH）、表面活性劑（吐溫20）、高鹽溶液（NaCl）；樣品溶解液一般為質譜兼容的揮發性鹽溶液（NH4HCO3）。可采用已知的活性分子模擬篩選流程，以選擇最佳的緩沖液條件。

4．實驗盡量減少假陽性結果，是高質量SPR垂釣實驗的成功標志。為此，可通過對照實驗和驗證實驗實現這一目標。對照實驗：使用空白的CM5芯片重復垂釣過程，將回收到的樣品作為陰性對照品進行質譜檢測，在后續的數據分析中作為背景對照扣除。驗證實驗：鑒定出活性分子后，應獲取其單體，采用SPR進行親和力測定，以判斷結合的特異性。如果同時鑒定出多個活性分子，也可以對他們的動力學或熱力學參數進行比較分析，從而排除假陽性結果。

研錦生物可以利用基于靶點或小分子結構的藥物設計方法，對可購買化合物、天然產物等數據庫進行虛擬篩選，并獲得潛在活性的化合物列表供進一步活性實驗確證。面向制藥企業和科研院所，可提供一站式的早期藥物研發服務，包括虛擬藥物篩選、先導優化、靶標預測、 動力學模擬等，涉及小分子化學藥、生物藥、中藥等多種新藥類型，為您提供優質的藥物發現服務