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重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹

       分離純化處于重組蛋白表達(dá)的下游處理（downstream processing）階段，且與上游過(guò)程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)等。所以在對(duì)目的蛋白表達(dá)純化時(shí)，要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游對(duì)下游      的影響。同時(shí)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過(guò)程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)      定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細(xì)胞外）

       由上表可知選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細(xì)胞的步驟，而且細(xì)胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)重組蛋白時(shí)，重組蛋白通常是可溶性表達(dá)，但也易形成包涵體?？扇苄缘鞍淄枰獜?fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離且純度較高，但回收具有生物活性的蛋白質(zhì)卻變得相當(dāng)困難，      通常需要對(duì)聚集的蛋白進(jìn)行變，復(fù)性，而通常情況下活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借多年的蛋白表達(dá)服務(wù)操作經(jīng)驗(yàn)和相關(guān)的技術(shù)，可以提供可溶性重組蛋白保證型服務(wù)和更高純度的上清蛋白。

分離純化原則總結(jié)：
1.應(yīng)盡可能利用蛋白質(zhì)不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同技術(shù)多次純化；
2.不同的蛋白在性質(zhì)上有很大區(qū)別，每一步純化步驟都應(yīng)當(dāng)充分利用目的蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)差異；
3.在純化早期階段要盡量減少處理體積，方便后續(xù)純化；
4.在純化后期階段，再使用造價(jià)高的純化方法，有利于純化材料的重復(fù)使用，減少再生復(fù)雜性。

色譜法分離純化蛋白質(zhì)
色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。所有的色譜系統(tǒng)都由倆個(gè)相組成：固定相（固      體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分）和流動(dòng)相（水和其他溶劑）。當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固體相時(shí)，各組      分與倆相發(fā)生相互作用（吸附，溶解，結(jié)合）并因作用力的不同導(dǎo)致流出時(shí)間上的差異，分部收集流出液，可以得      到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到分離各組分的目的。
色譜層析分離純化蛋白質(zhì)有多種方法，包括凝膠過(guò)濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色譜高效液相色譜等。      其中親和色譜在重組蛋白純化中的應(yīng)用中最為廣泛。

親和色譜
原理
親和色譜是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有的特異性親和力，從而達(dá)到分離的目的。即將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱，      使得樣品混合物流經(jīng)色譜柱時(shí)，與親和配基能結(jié)合的物質(zhì)就被選擇性地吸附下來(lái)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，      從色譜柱中流出，使用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。
親和色譜具有高選擇性，高分辨率和高容量的特點(diǎn)，并且親和色譜純化過(guò)程簡(jiǎn)單，迅速，且分離效率高。并且可用      于純化生物大分子、稀溶液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白的貯藏、從純化分子中除去殘余污染物等。但其必須針對(duì)某一分離      對(duì)象，制備專一的配基和尋求穩(wěn)定色譜的條件，且成本較高。

實(shí)驗(yàn)案例（從E.coli 中提取誘導(dǎo)表達(dá)的GST 標(biāo)簽融合蛋白）

簡(jiǎn)介
谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和標(biāo)簽是純化重組蛋白的常用方法，該方法以 GST 能夠偶聯(lián)在介質(zhì)上的谷胱甘肽配體結(jié)合為基礎(chǔ)。同時(shí)，帶有 GST 的蛋白與配體結(jié)合是可逆的，能夠在溫和，非變性的條件下通過(guò)加入還原型谷胱甘肽被洗脫下來(lái)。

材料
BL21 感受態(tài)細(xì)胞、PGEX 表達(dá)載體、LB 培養(yǎng)基、Amp（氨芐青霉素）、IPTG、蛋白酶抑制劑、緩沖液 1（100mmol/L Tris，PH 8.5，500mmol/L NaCl）、緩沖液 2（100mmol/L NaAc，PH 4.5，500mmol/L NaCl）、PBS 緩沖液（100mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4）、洗脫緩沖液（50mmol/L Tris，PH 8.0，10mmol/L GSH）、微量紫外分光光度計(jì)、超聲波破碎儀、高速冷凍離心機(jī)、GST 柱

方法
一、載體構(gòu)建和細(xì)菌培養(yǎng)
5.采用 RT-PCR 擴(kuò)增得到目的基因，構(gòu)建到表達(dá)載體（PGEX-4T-1）上；
6.用構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌 BL21，LB 平板 37℃；
7.LB 平板上挑取單一菌落接入 5mL LB 培養(yǎng)基（100ug/mL Amp）中，37℃培養(yǎng) 3~5h；
8.將 5mL  菌液接入 1L LB（100ug/mL Amp）液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD60≈0.6，加入 0.3mmol/L  的IPTG； 9.    16℃誘導(dǎo) 16h；
10. 將培養(yǎng)好的菌液于 5000r/min 離心 10min，棄去上清液，收集菌體，離心后菌體沉淀懸浮于 25mL Binding buffer 中 。

二、細(xì)胞破碎和蛋白分離
1.往懸浮好的菌液中加入適量蛋白抑制劑（10uL  的 10mg/mL antipain，10uL  的 10mg/mL leupeptin  和 1mL的 1mol/L PMSF），冰浴放置；
2.超聲破碎，每個(gè)循環(huán) 26 次，超聲 6s，間隔 5s，視破碎效果共 2～4 個(gè)循環(huán)，破碎后的菌體 4℃ 1800r/min
3.離心 30min，上清保持在 4℃；
4.GST 柱先用 PBS 緩沖液平衡，上樣結(jié)合 30~60min，每 5~10min 攪拌一次，流干；
5.用 2~3 倍體積 PBS 緩沖液平衡清洗非特異性蛋白，流干，加入 15mL 洗脫緩沖液洗脫；
6.由于殘存少量蛋白酶，洗脫出來(lái)的目的蛋白溶液可于 4℃保存幾小時(shí)；
7.SDS-PAGE 檢測(cè)初步純化效果，進(jìn)行下一步純化步驟。

三、蛋白檢測(cè)和 GST 柱的恢復(fù)
1.用 3 倍柱體積的 6mol/L 鹽酸胍處理柱子 10min；
2.用 3 倍柱體積的水洗柱 2～3 次；
3.用 3 倍柱體積的緩沖液 1 處理柱子 10min；
4.用 3 倍柱體積的緩沖液 2 處理柱子 10min；
5.再次重復(fù) 3，4 步驟倆次；
6.用 3 倍柱體積的水洗柱 2～3 次；
7.用 3 倍柱體積的 PBS 緩沖液洗柱 2 次；
8.往柱內(nèi)加 3 倍體積 PBS 待用。

四、問(wèn)題分析及解決方案
GST 標(biāo)簽蛋白不結(jié)合柱子或結(jié)合能力非常弱的原因及解決辦法原因
1.過(guò)分的機(jī)械裂解使標(biāo)簽蛋白表性，阻止結(jié)合；
2.GST 標(biāo)簽蛋白在樣品中有聚集，導(dǎo)致沉淀；
3.標(biāo)簽蛋白濃度過(guò)低；
4.標(biāo)簽蛋白可能改變了 GST 構(gòu)相；
5.平衡時(shí)間過(guò)短。

解決方法
1.裂解過(guò)程中，采用溫和的裂解條件；
2.在細(xì)胞裂解前的緩沖液中加 DTT；
3.濃縮樣品，結(jié)合能力依賴濃度；
4.可以通過(guò)降低結(jié)合的溫度來(lái)改善結(jié)果；
5.確認(rèn)至少用 5 倍柱體積的 PH 6.5~8.0 的緩沖液平衡過(guò)。