LSPR技術
技術指南：COOH傳感器與胺偶聯試劑盒
1、概述
在COOH傳感器芯片表面上具有均勻的的羧基層。這些羧基能夠被標準EDC/NHS化學物激活并通過氨基化學偶聯配體 （圖1）。Nicoya胺基偶聯試劑盒中包含所有完成該偶聯所需的試劑而且試劑盒已被優化為最佳性能。這種耦聯方法使得配體穩定的附著于表面，并且結合的相互作用可以很容易在OpenSPR儀器上測量。
共價偶聯
2、實驗需要的試劑及儀器
● COOH傳感器芯片：儲存在2-8°C
● NHS：儲存在2-8°C，一旦稀釋分裝，儲存在–20°C
● EDC：儲存在2-8°C，一旦稀釋分裝，儲存在–20°C
● 激活緩沖液：儲存在2-8°C
● 封閉液：儲存在2-8°C
● 運行緩沖液：1X PBS pH 7.4（需要老師配）
● 80%的IPA （異丙醇）（需要老師提供）
● 去離子水（需要老師提供）
● 瞬時離心機（需要老師提供）
● 移液槍及槍頭（1ml，200ul，100ul）（需要老師提供）
● 配體（固定到芯片）：蛋白純度高于90%，濃度（30-100ug/ml），體積大于200ul
● 分析物：蛋白或大分子濃度（30-100ug/ml），體積大于200ul，小分子（溶于DMSO的）要求濃度大于100uM 或30mg/ml
● 再生緩沖液100mM的HCL，或1%的SDS
EDC分裝準備
1）將EDC溶解于1mL活化緩沖液中
2）用移液器分裝成10個100μL，儲存在–20°C.
NHS 分裝準備
1）將NHS溶解于1mL活化緩沖液中
2）用移液器分裝成10個100μL，儲存在–20°C.
注：試劑必須從分裝瓶里現取現用，且在使用前混合。EDC / NHS酯的半衰期較短，因此配體激活后立刻上樣。此外，蛋白質長時間在低pH值下通常不穩定，所以配體稀釋到激活緩沖液后要立即注入。
再生緩沖液參考：
1. Acid 5-150 mM | 2. SDS 0.01 – 0.5% |
Proteins | Peptides |
Antibodies | Proteins/Nucleic acids |
3. NaoH 10 mM | 4. IPA:HCl 1:1 |
Nucleic acids/Nucleic acids | ■Lipids |
緩沖條件
通常將大的配體如蛋白質固定在COOH傳感器芯片上的方法預富集。預富集是利用靜電力在傳感器的表面增加配體的局部濃度的技術。Nicoya為預富集提供了優化的激活緩沖液與胺偶聯試劑盒。不能被預富集的配體，需要通過其他方法固定，如通過組氨酸標簽捕獲偶聯。
注意，緩沖液中胺組或強親核試劑如Tris或疊氮化鈉應避免與胺基耦聯，因為這些基團將與配體競爭。
如果胺基耦聯試劑盒不能達到足夠的固定水平，可嘗試增加的配體的濃度。如果它仍然不夠，則需要進一步優化激活緩沖液。
3、COOH傳感器芯片實驗步驟：
注–本程序假設儀器中使用的是100μL的樣品環。如果要安裝更大的樣品環，則需要重新調整體積。
1）按照標準程序，在OpenSPR儀器上安裝羧基傳感器芯片。
2）開始以最大流速運行緩沖液（ex.1X PBS pH 7.4）。
3）在達到信號基線后，從上樣口注入80%的IPA，將控制閥轉到inject，運行10s轉回到load進行排氣泡，達到基線后，緩沖液沖洗樣本環，并用空氣排空。
4）注入10mM的Hcl 清洗芯片表面，運行1min（芯片第一次用時需要此步驟）
5）減慢緩沖液流速至20μl/min。
6）解凍并立即混合1等分的EDC和NHS，注入到儀器中。與傳感器相互作用5分鐘。一旦相互作用結束，用緩沖液沖洗上樣口并用空氣排空。
7）用激活緩沖液稀釋用于固定的配體， 體積為200μL濃度為10-50μg/mL。稀釋后立即將配體注入儀器（相互作用5分鐘 ）。在EDC / NHS完成抽吸后，這步需要快速連續的進行。用緩沖液沖洗上樣口并用空氣排空。
單位換算：10ug/ml=10mg/L=[10mg/MW/mol)]/L=?mM/L = ?uM/L)
8）注入250μL封閉液（互相作用5分鐘 ）。一旦封閉液已經通過，傳感器就可準備用于測量分析物和配體之間的結合相互作用。沖洗和清除樣品回路。
9）通過比較EDC/NHS活化前與閉鎖后的信號，測量配體結合量。在圖2所示的示例中，它是約700pm。
10)如有已知的再生緩沖液條件，將泵的速度提高到150ul/min，注入再生緩沖液初始化配體表面。
11）將泵速調到20ul/min,注入高濃度的分析物以確認配體的活性，并確認表面的近似的最大結合能力。清洗及排空樣本環。
12）提高泵速到150μL/min，準備適當的再生緩沖液和裝載250μL并注入以去除分析物。芯片表面即可用于分析物動力學分析。
如下圖所示的例子。
圖2 COOH傳感器芯片配體的制備
更多資料請點擊查看附件
