Fret熒光共振能量轉移
Fret 熒光共振能量轉移
對于分子生物學來講，生物分析手段的發展，是闡明機理的必要條件。在研究分子間相互作用的道路上，人們不斷 探索，總結出很多方法，免疫技術，晶體衍射，核磁共振等。1948 年，熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）理論被首次提出，它可以測定 1.0-6.0nm 距離內分子間的相互作用。1967 年，這一理論得到了實驗驗證，將 1.0-6.0nm 的距離稱為光學尺。二十世紀八十年代出，通過科學家的不斷探索，Fret 技術成功運用到蛋白質結構的研究中。自 Fret 熒光共振能量技術誕生以來，已結合多種先進的技術和方法，如電子顯微鏡，X 射線衍射等，推動了分子生物學檢測手段的發展。
作用原理
熒光共振能量轉移技術，是采用物理方法去檢測分子間的相互作用的方法。 他適用于在細胞正常的生理條件下，驗證已知分子間是否存在相互作用。此方法的檢測原理如下；
將我們要檢測的蛋白（如圖 X 和Y），分別偶聯上 D 和A 熒光蛋白，D 和A 是一對熒光物質，我們稱之為供體（donor）和受體（acceptor）。當用 430nm 的紫光去激發 X 融合蛋白時，它能夠產生 490nm 的藍色熒光；同樣，當我們用 490nm 的藍光去激發 Y 融合蛋白時，它能夠產生 530nm 的黃色熒光。（結合圖 1） 。
當蛋白 X 和 Y 間沒有相互作用時（兩者的空間距離>10nm），融合蛋白 X 和 Y 分別產生相應的熒光而被檢測到，如果蛋白 X 和 Y 間存在相互作用（兩者的空間距離需<10nm，結合圖 2），用紫光激發融合蛋白 X 其產生的藍光會被融合蛋白Y 吸收，從而產生黃色熒光，這時，在細胞內將檢測不到藍色熒光的存在。這時因為能量從 X 融合蛋白轉移到了 Y 融合蛋白，這就是熒光共振能量轉移技術。
技術難點
一個理想的 Fret 相互作用體系，要求要有一對合適的熒光物質， 即供體的發射光譜與受體的吸收光譜有明顯的重疊。且當供體的激發波長時對受體無影響，供體和受體的發射光譜要完全分開，否則容易造成光譜干涉，而使反應 體系不穩定。目前，較為常用的供體-受體分子對，主要有綠色熒光蛋白類（GFPs）和染料類。綠色熒光蛋白類有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP 等，染料類的有 Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine 等。且這些熒光物質要能夠標記在研究對象上。
應用要求
供體熒光基團和受體熒光基團的空間距離要<10nm； 供體的發射光譜與受體的接收光譜有相當的重疊；
供體、受體分子在量子產率、消光系數、水溶性、抗干擾能力等方面要求較高。
優缺點
優點 | 缺點 |
在活細胞的正常生理條件下進行檢測，觀察大分子在細 胞內的構象變化與相互作用，并彌補了需破碎細胞檢測 相互作用的缺點；靈敏度高，可實現對單細胞水平的研究，研究單個受體 分子；可與多種儀器和技術結合使用，如顯微鏡，色譜技術，電泳，流失細胞技術等； | 應用比較局限，一般需要在待檢測分子上偶聯熒光物質（加上記）； |
應用
細胞內分子間的相互作用
膜蛋白的研究
細胞膜受體蛋白間的相互作用
細胞凋亡的研究
核酸檢測
實驗流程簡述
以熒光物質 CFP（供體）-YFP（受體）為例，檢測 AB 蛋白在細胞內的相互作用。
1.細胞培養：根據實驗培養特定的細胞用于轉染，觀察檢測分子在細胞內的相互作用；
2.細胞轉染：構建質粒載體 CFP-A 和 YFP-B，將檢測的 AB 蛋白分別偶聯上熒光蛋白 CFP 和 YFP，并將兩個質粒共轉染到培養的細胞內；
3.檢測 FRET：質粒載體 CFP-A 和 YFP-B 轉染細胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢測，是否發生 Fret；
4.FRET 圖像采集： 確定 FRET 配對的激發波長， 藍光被調諧分別用于探測最大和最小的供體和受體信號， 最大供體信號和最小受體信號對應的波長用于收集雙表達細胞的 FRET 信號。調整激光變化，以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP 信號的激發光波長，采集供體和受體圖像，收集 FRET 信號。每個細胞 FRET 檢測重復 3 次，每種轉染至少完成 6 個細胞的 FRET 檢測;
5.FRET 數據處理： 去除 FRET 信號中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號； 受體通路的 FRET 信號需要對
供體受體光譜靈敏度的變化進行矯正、對自發熒光和光學噪聲進行矯正； 利用矯正系數對雙標定細胞進行象素匹配矯正。
