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分子互作資料

biocore技術

應用指南

BiacoreTM系統幵展免疫原性檢測

Biacore1

介紹

免疫原性是指生物藥物被注射到病人體內引起不必要的 免疫應答的藥物屬性。由于影響藥物的安全性和有效性, 當幵發新型蛋白藥物時,免疫原性是必須考慮的重要方 面。免疫原性測試需要在臨床前和臨床階段進行。 美國食品藥品監督管理局的《工業指南:治療性蛋白免 疫原性測試的方法幵發》⑴列明:免疫原性檢測方法 除靈敏度要求外,還必須能夠檢測所有抗體亞型,特別 是IgM和IgG亞型。推薦的靈敏度是250到500ng/ml。免 疫原性分析包括三個步驟:陽性藥物的篩選、驗證和表 征。初步篩選中可能會產生假陽性結果,因此,在初步 篩選后通常需要進行驗證。經過對陽性樣品的鑒定和驗 證后,就可以對初篩結果中的抗藥抗體(Anti-Drug Antibodies, ADAs)幵展全面的研究,包括其亞型(類或 亞類)分析、結合穩定性、抗原表位特異性和中和能力, 這些數據為深入研究免疫應答提供了寶貴信息。
 

Aarden等人(2)觀察到IgG4是僅次于IgGl的由治療性單克 隆抗體(MAbs)產生的ADAs的主要亞型°IgG4—直與 治療性蛋白藥物的高劑量注射和長時間暴露下所產生的 免疫應答有關。由于IgG4型ADAs具有雙特異性(bi-specific nature),因此,其很難通過傳統的橋聯或均一的酶聯免 疫吸附法(ELISA)和增強性化學發光(ECLTM)方法檢測。 GE Healthcare提供了設計符合免疫原性分析流程通常所 要求的,符合GLP/GMP管理規范的系統。本文中的實例 展示了非標記生物物理互作分析方法是如何成功地應用 于免疫原性研究流程的所有環節,并確保免疫應答的高 可信度檢測、驗證和全面表征的(圖1)。同時,本文也 對Biacore系統和表面等離子體共振(SPR)技術的優勢 與傳統技術進行了比較。

Biacore2

圖1.—個典型的用于免疫原性分析的多步流程,包括篩選以發現陽性樣品、陽性樣品的驗證以及對確認的陽性樣品 的進一步表征。測試范圍根據法規、藥物類型和臨床前/臨床階段的不同要求而不同°Biacore系統在整個工作流程中 提供了寶貴的信息。
 

公認的靈敏度及對咼、低親和度抗藥抗 體的檢測—種經過驗證的,基于Biacore 3000系統構建的,針對 darbepoetin alfa 和epoetin alfa 的ADAs 篩選方法的檢測 靈敏度分別可以達到100ng/ml和80ng/ml(3)。另一個研 究報道稱,Biacore對romiplostim和促血小板凝集素的 ADAs的檢測靈敏度分別達到400ng/ml和200ng/ml。除 了達到法規要求的靈敏度外,Biacore系統還提供了寶貴 的動力學信息,并同時能夠檢測高、低親和度的抗藥抗體。

在下面的例子中,勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)在對治療用人源化抗體在臨床I期多劑量研 究中比較了Biacore檢測法和橋聯ELISA檢測法。結果顯示,Biacore T1001檢測法相比ELISA檢測法可以更早地 發現陽性樣品(圖2)。這些早期免疫應答的ADAs抗 體通常具有低親和度,且具有快結合/快解離的動力學 特征。盡管ELISA檢測法的靈敏度相對較高,但由于考 慮到需同時對早期和成熟期的免疫應答都做出檢測的重要性,Boehringer Ingelheim 最終選擇了 Biacore 檢測
法作為他們免疫原性的篩選手段。

Biacore3
圖2.優化的Biacore検測法在第一次注射(藍色柱)兩到三周后便能検測 到“持久性”和“過渡性”的免疫應答,而橋聯ELISA検測法只能在注 射后12周后的“持續性”免疫應答階段做出検測,但是“過渡性”的免 疫應答階段根本無法検測。

Biacore檢測法可以檢測低親和度ADAs的優勢也被Lofgren 等所證實⑸。他們比較了橋聯ELISA方法與Biacore 方法對于全人源panitumumab( 一種與EGF受體結合的 單克隆抗體)的免疫原性分析°ELISA檢測法對高親和 度的ADAs檢測更加靈敏,但是Biacore檢測法對于低親 和度ADAs的檢測相比而言卻靈敏得多。對于來自臨床 試驗的樣品,Biacore檢測法比ELISA檢測法可以檢測到 更多的陽性樣品。此外,Biacore方法還利用中和抗體 (Neutralizing Antibodies, NAbs)發現了8種陽性樣品, 而這些樣品在用ELISA方法檢測時卻被遺漏了。

 

大量關于應用橋聯ELISA檢測法和Biacore免疫原性檢測 法對臨床樣品的檢測結果的比較總結于表1。在所有的 情況下,Biacore方法能夠比ELISA方法檢測到更多的陽 性樣品。一個可能的原因是由于使用Biacore檢測法可 以檢測到那些低親和度且快速解離的ADAs和IgG4 (見 下文)。

Swanson等人展示了那些在Biacore方法中可以檢測到 而在ELISA方法遺漏的ADAs的臨床意義(6)。來自8個 患有抗體(Ab)介導的純紅細胞障礙性貧血病人的樣 品通過Biacore方法檢測為陽性,但其中兩個樣品在ELISA 方法中的檢測結果卻為陰性。


表1.利用ELISA和Biacore檢測法檢測的ADA陽性臨床樣品

 

藥物

陽性數量(ELISA檢測法)

陽性數量(Biacore檢測法)

碘131嵌合型腫瘤
壞死單克隆抗體(7)

4/78

7/78

生物治療藥物Merck Serono*

19/62

15/62

Panitumumab (5)

2

25^/612

重組人促紅細胞 生成素⑹

6/8§

8/8§

 

*在2011年慕尼黑生物制品免疫原性會議上展示的酸解離檢測法

+其中一個被發現在基于細胞的檢測法中具有中和效果

:其中八個被發現在基于細胞的檢測法中具有中和效果

§所有八個樣品都來自具有抗體介導的純紅細胞障礙性貧血病人

Nechansky等人也觀察到Biacore方法可以檢測到顯然更 多的ADA樣品數(8),并得出結論-表面等離子共振技 術(SPR)是首選方法,這主要是由于Biacore能夠檢測 低親和度的ADAs,同時提供定量數據,例如結合和解離 速率以及亞型的鑒別。

 

對ADAs抗體的自動帶藥篩選

 

藥物干擾對于所有免疫原性檢測法都是一個棘手的挑戰, 特別是那些用于治療性單克隆抗體,藥物經常以相當高 的劑量給藥,并擁有較長的半衰期。樣品中所存在的藥 物能夠結合ADAs,并阻止ADA與偶聯(包被)在芯片上 的藥物分子結合,因此會產生假陰性結果。Biacore T200 系統通過自動酸化解決了這個問題,它能夠在存在過量 藥物的環境下對ADAs進行檢測。樣品通過酸化,使得藥 物-ADA復合物解離,然后在測定即將幵始前被中和,從 而避免重新形成藥物-ADA復合物。自動酸化的優點是樣 品只需要被短暫酸化,且對于所有樣品酸化時間都是固 定的。

這種酸解離策略使得Biacore檢測方法在藥物存在時也能 夠達到推薦的靈敏度。例如,不同濃度的抗rituximab抗 體與濃度逐級增加的藥物(rituximab)混合。在存在100 倍過量(摩爾比)的rituximab的情況下檢測到有0.5 g/ml 的抗rituximab抗體(圖3)。

Biacore4
圖3.使用(紅色)或不使用(藍色)酸解離策略在存在不同濃 度rituximab下對0.5 n g/ml的抗rituximab抗體的檢測。

 

英國伯明翰大學的一個研究小組分析了來自SLE病人的臨 床樣品中抗rituxima b抗體和rituxima b的水平⑼。在裝有免 疫原性模塊的Biacore T100儀器中采用酸解離操作發現了 樣品中以前被rituximab所掩蓋抗rituximab抗體。酸化分析 也顯示樣品中rituximab的存在,而不采用酸化則不能檢出 其存在。在2011年慕尼黑生物制品免疫原性會議上,來自 Merck Serono的Kramer博士展示了采用酸解離方法的自動 化Biacore檢測法的結果,并與基于ELISA的酸解離檢測法 進行比較。當將69個臨床樣品進行比較時,相同的陽性 樣品在兩種檢測法中都被檢出(部分結果被顯示在圖4中)。 然而,Biacore T100檢測法卻發現更多的陽性樣品,對于 這種行為的可能的解釋是Biacore檢測法也可以發現那些具 有低親和度的ADAs,因為它們可能在ELISA的洗滌步驟被 洗掉。

Merck Serono發現Biacore T100檢測法可以實現卓有價值 的自動化運行,節省勞動力成本和降低出錯的風險。這在 檢測方法被轉移到CRO公司時凸顯巨大的優勢。相比而言, ELISA檢測法的步驟較為繁瑣,包括多步手動移液操作, 并且一般需要三天左右才能獲得結果。

 ELISA工作流程
 

第一天

第二天

第三天

第四天

?固定

?樣品稀釋

?洗滌

?評估

?孵育12小時

? 酸化

?酸化5分鐘



? 中和

?中和5分鐘,并轉移到新的微孔板

?孵育12小時

?洗滌,封閉1小時


?洗滌,加入第二種試劑1小時

?洗滌,加入HRP共軛物30分鐘

?加入終止溶液30分鐘

?讀取微孔板

Biacore工作流程

第一天

第二天

第三天

?固定

?具有自動酸化和中和的無人值守檢測,時間取決于樣品數量

?評估

?加入樣品和試劑

?開始檢測


Biacore T100檢測法可以將樣品的制備工作量降至最低。 與ELISA檢測法相比,很少的手動操作為Biacore檢測法 提供了更高的精確度(表2)。

圖5Biacore和ELISA免疫原性檢測法工作流程

Kramer博士認為,“Biacore看起來是一種應用酸解離檢 測法的理想技術”,Merck Serono正在多個項目中使 用Biacore系統幵展基于酸解離的免疫原性篩選檢測法。 表2.具有酸解離的檢測法批次間精確度比較。數據由 Merck Serono友情提供

ELISA,百分比偏差 Biacore, 百分比履

選樣 時間

患者A

Biacore 檢測法 ELISA

患者B

Biacore 檢測法 ELISA

患者C

Biacore 檢測法 ELISA

患者F

Biacore 檢測法 ELISA

幵始前





168 h




?

240 h




?

312 h



?

?

480 h




?

648 h

? ?

?

? ?

? ?

816 h

? ?

? ?

? ?

? ?

984 h

? ?

? ?

? ?

? ?


圖4.病人臨床樣品中ADAs的檢測。

大分子應用專題

通過驗證實驗去除假陽性結果

藥物競爭檢測法通常被用于驗證陽性響應是由于ADAs 特異結合于藥物,而不是與其他血清組分的相互作用。 驗證實驗很容易在Biacore系統上進行;添加過量的藥 物到樣品中從而抑制結合響應值,以證明響應是來自 ADAs與傳感器表面上的藥物之間的特異結合(圖6)。 整個程序可以實現自動化。
Biacore8

 


圖6使用Biacore系統的驗證分析。

對ADAs的綜合表征

 

在陽性樣品的鑒定和驗證后,可以使用Biacore分析進行 全面的表征。競爭性配體結合分析、亞型分析(種類或 亞型)、結合穩定性、抗原表位特異性和中和能力研究 都為全面認識免疫應答的性質提供寶貴信息。Biacore T200提供專門的軟件工具模塊用于亞型分析和結合穩定 性測試。
 

ADAs的亞型分析
 

ADAs的亞型分析提供了關于ADAs的免疫功能的信息,例 如抗體Fc受體結合。亞型分析流程如圖7所示。在Mytych 等的研究中,含有抗darbepoetin alfa的血清ADAs的12個 臨床樣品被用于幵展亞型分析⑶。所有樣品均分別對 應某種特定的抗體亞型,四個主要的抗體亞型都被檢測 出來。大多數ADA陽性樣品含有IgG和IgM類型。此外, 還發現了三個樣品呈現IgA陽性,一個樣品呈現IgE陽性。
Biacore9

圖7.利用Biacore對亞型進行分析。來自樣品的ADAs可以與固定在表面 的藥物結合。然后,一系列抗亞型的抗體流過已結合上去的ADA,產 生響應則表示存在不同的亞型。在這個圖中,抗igG2b試劑提供明顯 的響應,鑒定出所結合的抗體為lgG2b亞型。

IgG4的檢測
 

正如美國食品和藥物監督管理局(FDA)所要求的,免 疫原性檢測法應該能夠檢測所有的IgG亞型(i)°IgG4 是治療性單克隆抗體的主要的一種ADAS亞型(2,6),部 分I gG4可以通過抗體間的隨機交換重組,造成抗體雙特 異性(圖8A)。雙特異性的ADAs在橋聯或同源檢測方式 法中無法檢出(圖8B),因而很難通過常見的ELISA或ECL 方法檢測的到。然而,IgG4在Biacore系統的直接結合模 式中可以被檢測到。

Biacore11       

圖8.雙特異性ADAs在橋聯ELISA檢測法中不能被檢測到°(A)在人抗 體之間自發和隨機地發生交換,造成其中一些具有雙特異性。(B) 雙特異性IgG4在橋接ELISA中將不會被檢測,因為它們必須有兩種藥物 分子與一個ADA的結合。

抗原表位特異性的測定
 

在研究免疫原性時,ADAs的抗原表位特異性的測定十分 重要。根據FDA的建議(1),申請人應該研究在抗原上 的哪些區域產生了免疫應答:“FDA建議申請人直接針 對完整分子和內源對應物進行初步篩選試驗。然而,對 于產品幵發,申請人應該研究導致免疫響應產生的特異 抗原區域或“抗原表位”。這種測定方法對于融合分子 可能尤為重要,因為兩個蛋白是通過基因或物理手段被 “融合”在一起的??梢栽诤Y選階段就利用Biacore系統 進行抗原表位特異性的測定。一個便捷的方法就是固定 全長的藥物在一個流動池(Flow cell)中,同時固定藥 物的不同結構域在其他流動池中(圖9)。

Biacore12


圖9.同時進行抗原表位作圖和亞型分析的檢測方法。

 

交叉反應也可以采用相同的模式進行測定,但是在每個 流動池中固定不同的藥物。為了評估抗darbepoetin alfa 抗體是否存在潛在的對epoetin alfa的交叉反應,Mytych 等幵發了一種基于Biacore的雙流動池生物傳感器免疫檢 測法,其中含有一個固定有epoetin alfa通道(3)。這 種免疫檢測法被Amgen公司作為首選方法,用于檢測和 表征人血清中的抗epoetinalfa和抗darbepoetin alfa抗體。
 

Stubenrauch等人幵展的工作證明,可以通過很少量的 Biacore實驗中獲取豐富的信息(10)。通過高效地利用 這四個流動池,可以對每個樣品進行整合11種指標的完 整的的免疫原性檢測,包括臨床樣品中ADAs的應答、亞 型、特異性和結合穩定性等信息(圖9)。這種方法可將 來自藥物的特異性應答與其他應答區分幵來,例如抗Fc 片段的IgM類風濕性因子應答。研究者可以跟蹤特定的 ADA形成的時間進程,可以實現針對每個病人的ADA應 答分析,并與臨床觀察相關聯。評估ADA結合穩定性一 般來說,在生物分子相互作用實驗中,解離速率是一種 可以估計結合親和度的指標,抗體朝著更高親和度方向 上成熟通常會反映在更慢的解離速率上°Biacore系統能 夠通過對評估抗體亞型和結合穩定性來監控ADA的成熟 過程。陽性臨床樣品中的ADA集群可以通過ADA與固定 于芯片的藥物之間的結合穩定性來表征(圖10)。
Biacore13

圖10.Biacore表征陽性臨床樣品中ADA與到固定于芯片上的藥物的結合 穩定性。免疫應答成熟通常帶來更慢的解離速率(下圖)。

 

評估ADA的親和度或解離速率通常較難,因為,多數抗 體是二價的和異源的°Biacore T200軟件提供了專用工 具,可用來區分快速解離和緩慢解離的抗體組分造成的 免疫響應。
 

Mytych等介紹了另外一種用于評估臨床樣品中ADA的解 離速率的方法,通過記錄ADA幵始解離前和解離40分鐘 后的響應信號來計算信號損失百分比。6個臨床樣品的 結合信號在幵始解離40分鐘后降低大約68%和89%,而

高親和度的陽性對照則幾乎沒有解離。

無需標記的競爭性配體結合檢測法

作為ADA表征的一部分,確認為陽性的樣品需要進一步 檢測中和抗體(Nab)的存在°NAb對治療性生物藥物 有中和作用。常規的Nab檢測法是基于細胞的方法,而 這些檢測法通常很繁瑣,且重復性差。作為一種替代方 法,競爭性配基結合(Competitive Ligand Binding, CLB) 檢測法會在有些時』候被研究者所使用。根據EMA指南草案, 對于單克隆抗體藥物,CLB檢測法通常作為首選方法, 而不是生物檢測法(11)。來自四個公司的案例研究已 經證明,生物檢測法和CLB檢測法提供結果可比的NAb的 檢測(12)"LISA或ECL等需要標記的檢測方法很可能 對NAb的檢測產生不利的影響。Biacore系統上進行的CLB 檢測法不需要標記,并可以實現完全自動化。Biacore CLB檢測法的原理如圖11所示。

 

Biacore13
圖11具有藥物中和效果的ADA在CLB檢測法中被檢測。

檢測(診斷)試劑的可靠鑒定和驗證

經過驗證和全面表征的試劑是保證任何檢測方法的有效 性的先決條件-Biacore系統提供關于檢測/診斷試劑性 質相關的詳細信息,例如抗體-抗原結合的特異性、動力 學和親和度,這對于在方法幵發過程中選擇最優的試劑 十分重要。對于某些需要二級檢測試劑的方法(如二抗 等),鑒定多種檢測試劑彼此之間同時且獨立地結合于 各自抗原至關重要。這種鑒定可以在Biacore系統上很容 易實現,通過使用成對的抗原表位作圖功能自動的完成。 除此之外,Biacore方法還能獲得的的動力學和親和度信 息,可以幫助研究者優化檢測方法的性能,且不會增加 對成本和其他資源的消耗。這些應用的例子包括Merck Seron。公司,該公司的研究人員使用Biacore系統甄選最 優的抗體用于磷酸激酶的檢測,也用于分析抗體的生物 素化修飾可能對橋聯免疫檢測方法的潛在影響。

 

致謝

有關方法比較、酸解離方法和驗證的數據由德國默克雪 蘭諾(Merck Serono)公司的Kramer博士友情提供;免 疫原性相關的篩選數據由勃林格殷格(Boehringer Ingelheim) 公司友情提供。

 

技術概述

利用Biacore系統的 結合強度和動力學

Biacore系統使用表面等離子共振(SPR)實時監測分子 相互作用。無需標記,Biacore檢測法提供關于分子相互 作用的親和度、動力學和特異性的信息。生物分子的活 性濃度也可以被測定。相互作用分子中的一個被固定于 傳感芯片表面上,而其他分子以液體形式流經傳感器表 面。

兩者之間的任何相互作用通過靠近傳感器表面的質量濃 度的變化(折光率變化)而被實時檢測,結合數據顯示 在傳感圖中,并對時間作圖,響應信號用RU表示。

復合物在相互作用過程中的形成和解離進程可以被實時 觀測,通過結合曲線的形狀可獲得的結合動力學信息 (ka , kd )。

可以在www.gelifesciences.com/biacore上找到更多信息
Biacore15

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A) B)

r

f寸

圖8.雙特異性ADAs在橋聯ELISA檢測法中不能被檢測到°(A)在人抗 體之間自發和隨機地發生交換,造成其中一些具有雙特異性。(B) 雙特異性IgG4在橋接ELISA中將不會被檢測,因為它們必須有兩種藥物 分子與一個ADA的結合。

抗原表位特異性的測定

在研究免疫原性時,ADAs的抗原表位特異性的測定十分 重要。根據FDA的建議(1),申請人應該研究在抗原上 的哪些區域產生了免疫應答:“FDA建議申請人直接針 對完整分子和內源對應物進行初步篩選試驗。然而,對 于產品幵發,申請人應該研究導致免疫響應產生的特異 抗原區域或“抗原表位”。這種測定方法對于融合分子 可能尤為重要,因為兩個蛋白是通過基因或物理手段被 “融合”在一起的。可以在篩選階段就利用Biacore系統 進行抗原表位特異性的測定。一個便捷的方法就是固定 全長的藥物在一個流動池(Flow cell)中,同時固定藥 物的不同結構域在其他流動池中(圖9)。

Stubenrauch等人幵展的工作證明,可以通過很少量的 Biacore實驗中獲取豐富的信息(10)。通過高效地利用 這四個流動池,可以對每個樣品進行整合11種指標的完 整的的免疫原性檢測,包括臨床樣品中ADAs的應答、亞 型、特異性和結合穩定性等信息(圖9)。這種方法可將 來自藥物的特異性應答與其他應答區分幵來,例如抗Fc 片段的IgM類風濕性因子應答。研究者可以跟蹤特定的 ADA形成的時間進程,可以實現針對每個病人的ADA應 答分析,并與臨床觀察相關聯。評估ADA結合穩定性一 般來說,在生物分子相互作用實驗中,解離速率是一種 可以估計結合親和度的指標,抗體朝著更高親和度方向 上成熟通常會反映在更慢的解離速率上°Biacore系統能 夠通過對評估抗體亞型和結合穩定性來監控ADA的成熟 過程。陽性臨床樣品中的ADA集群可以通過ADA與固定 于芯片的藥物之間的結合穩定性來表征(圖10)。

時間(s)

1000-

大分子應用專題

抗-IgM

第二次進樣: 抗亞型抗體

第一次進樣: 帶有ADA的樣品

2 全長治 療藥物

抗-IgG (LC)抗-IgG (Fc) 抗-IgE

3

治療性藥物 的Fab片段

4

治療性藥物 的Fc片段

流動池 1

(n叱)田=B1(n叱)田=

700

400

100

緩慢解離

(穩定的相互作用)

圖9.同時進行抗原表位作圖和亞型分析的檢測方法。

交叉反應也可以采用相同的模式進行測定,但是在每個 流動池中固定不同的藥物。為了評估抗darbepoetin alfa 抗體是否存在潛在的對epoetin alfa的交叉反應,Mytych 等幵發了一種基于Biacore的雙流動池生物傳感器免疫檢 測法,其中含有一個固定有epoetin alfa通道(3)。這 種免疫檢測法被Amgen公司作為首選方法,用于檢測和 表征人血清中的抗epoetinalfa和抗darbepoetin alfa抗體。

-200 ——

150

250

350

450

550

圖10.Biacore表征陽性臨床樣品中ADA與到固定于芯片上的藥物的結合 穩定性。免疫應答成熟通常帶來更慢的解離速率(下圖)。

評估ADA的親和度或解離速率通常較難,因為,多數抗 體是二價的和異源的°Biacore T200軟件提供了專用工 具,可用來區分快速解離和緩慢解離的抗體組分造成的 免疫響應。

Mytych等介紹了另外一種用于評估臨床樣品中ADA的解 離速率的方法,通過記錄ADA幵始解離前和解離40分鐘 后的響應信號來計算信號損失百分比。6個臨床樣品的 結合信號在幵始解離40分鐘后降低大約68%和89%,而

高親和度的陽性對照則幾乎沒有解離。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

無需標記的競爭性配體結合檢測法

作為ADA表征的一部分,確認為陽性的樣品需要進一步 檢測中和抗體(Nab)的存在°NAb對治療性生物藥物 有中和作用。常規的Nab檢測法是基于細胞的方法,而 這些檢測法通常很繁瑣,且重復性差。作為一種替代方 法,競爭性配基結合(Competitive Ligand Binding, CLB) 檢測法會在有些時』候被研究者所使用。根據EMA指南草案, 對于單克隆抗體藥物,CLB檢測法通常作為首選方法, 而不是生物檢測法(11)。來自四個公司的案例研究已 經證明,生物檢測法和CLB檢測法提供結果可比的NAb的 檢測(12)"LISA或ECL等需要標記的檢測方法很可能 對NAb的檢測產生不利的影響。Biacore系統上進行的CLB 檢測法不需要標記,并可以實現完全自動化。Biacore CLB檢測法的原理如圖11所示。

致謝

有關方法比較、酸解離方法和驗證的數據由德國默克雪 蘭諾(Merck Serono)公司的Kramer博士友情提供;免 疫原性相關的篩選數據由勃林格殷格(Boehringer Ingelheim) 公司友情提供。

技術概述

利用Biacore系統的 結合強度和動力學

+ 拮抗藥 物,例 I 如可溶

中和性抗 藥抗體

受體: 固定的 傳感器芯片

■ 性受體

SM)國國

AM)曰國

Biacore系統使用表面等離子共振(SPR)實時監測分子 相互作用。無需標記,Biacore檢測法提供關于分子相互 作用的親和度、動力學和特異性的信息。生物分子的活 性濃度也可以被測定。相互作用分子中的一個被固定于 傳感芯片表面上,而其他分子以液體形式流經傳感器表 面。

兩者之間的任何相互作用通過靠近傳感器表面的質量濃 度的變化(折光率變化)而被實時檢測,結合數據顯示 在傳感圖中,并對時間作圖,響應信號用RU表示。

復合物在相互作用過程中的形成和解離進程可以被實時 觀測,通過結合曲線的形狀可獲得的結合動力學信息 (ka , kd )。

可以在www.gelifesciences.com/biacore上找到更多信息

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

時間(S) 時間(S) 時間(S)

圖11具有藥物中和效果的ADA在CLB檢測法中被檢測。

檢測(診斷)試劑的可靠鑒定和驗證

經過驗證和全面表征的試劑是保證任何檢測方法的有效 性的先決條件-Biacore系統提供關于檢測/診斷試劑性 質相關的詳細信息,例如抗體-抗原結合的特異性、動力 學和親和度,這對于在方法幵發過程中選擇最優的試劑 十分重要。對于某些需要二級檢測試劑的方法(如二抗 等),鑒定多種檢測試劑彼此之間同時且獨立地結合于 各自抗原至關重要。這種鑒定可以在Biacore系統上很容 易實現,通過使用成對的抗原表位作圖功能自動的完成。 除此之外,Biacore方法還能獲得的的動力學和親和度信 息,可以幫助研究者優化檢測方法的性能,且不會增加 對成本和其他資源的消耗。這些應用的例子包括Merck Seron。公司,該公司的研究人員使用Biacore系統甄選最 優的抗體用于磷酸激酶的檢測,也用于分析抗體的生物 素化修飾可能對橋聯免疫檢測方法的潛在影響。


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