ExpiCHO-S重組蛋白表達
名稱 | ExpiCHO-S細胞F1電轉瞬時表達實驗方案 |
客戶 | XX客戶 |
ExpiCHO-S細胞F1電轉瞬時表達載體實驗方案
實驗準備階段
實驗準備
雙方按照表1進行實驗所需儀器及耗材準備。
表1：實驗所需試劑耗材
名稱 | 數量 | |
客戶 提供 | 細胞計數儀（Vi-Cell或其他計數儀器） | 1 |
蛋白質定量檢測相關儀器 | 1 | |
離心機（可以離心15ml、50ml） | 1 | |
帶搖床細胞培養(yǎng)箱37°C，8%CO2 | 1 | |
帶搖床細胞培養(yǎng)箱32°C，8%CO2 | 1 | |
37°C，5%-8% CO2靜置培養(yǎng)箱 | 1 | |
電轉細胞總量( CD04培養(yǎng)基培養(yǎng) ) | 1.2*10^9 | |
客戶抗體質粒A：lc、hc 客戶抗體質粒B：lc、hc | lc：200μg；hc：200μg lc：200μg；hc：200μg | |
500mL細胞搖瓶 | 2 | |
250mL細胞搖瓶 | 1 | |
50ml離心管 | 1包 | |
谷氨酰胺 | 按4mM添加至CD04培養(yǎng)基 | |
壹達 提供 | 電轉儀F1 | 1 |
EBEL Buffer | 125ml | |
15ml規(guī)格電極（銷售品） | 3+1 | |
15ml離心管（Nest） | 1包 | |
2×103A高濃縮補料 | 1瓶 | |
BR7補料 | 1瓶 | |
hIgG質粒 | 500μg | |
CD04培養(yǎng)基（電轉前、電轉后） | （500ml+500ml） | |
丁酸鈉（100mM，1：100） | 3ml |
2、實驗準備
2.1細胞準備：ExpiCHO-S細胞
由客戶提供的ExpiCHO-S細胞，以2-3×105/ml的密度進行接種培養(yǎng)，約72h（3天）后收集細胞（此時細胞密度約為4-6×106），進行傳代處理（傳3代后）進行細胞電轉染實驗。
為保持電轉穩(wěn)定性，建議：
①傳代后24-72h內進行電轉染，建議初始凍存細胞株復蘇后傳代3代及以上再進行電轉染；
②電轉前細胞密度建議3-6*10^6/ml，最高不超過8*10^6/ml，細胞活率：95%以上；
③細胞代數不宜過短與過長，目前做過3-15代內，蛋白表達均比較穩(wěn)定。
細胞培養(yǎng)條件：37°C，8%CO2，80%以上濕度，培養(yǎng)箱轉速120rpm，振幅25mm
2.2 質粒準備
質粒包含客戶提供的質粒A（lc、hc）；質粒B（lc、hc）。
質粒要求：大提后，以滅菌后的超純水溶解（質粒濃度須大于1μg/μl），不含TE、EDTA等螯合劑；去內毒素: 10EU/ml以下；A260/A280:1.8-2.0；瓊脂糖凝膠電泳檢質粒條帶清晰無雜帶，以超螺旋帶亮度是線性的1.5-2倍普通條帶最佳。
實驗方案及結果
H1質檢細胞狀態(tài)方案(略)
本方案不涉及H1質檢，因而略過。
2.F1電轉實驗方案
EBXP-F1流式電轉儀進行大體積電轉體系為：1×108//100μg/ml，具體電轉參數見表3；細胞電轉后，需置于37°C細胞培養(yǎng)箱內靜置孵育20min，取樣進行臺盼藍染色計數，以4×106/ml的活細胞密度接種至細胞培養(yǎng)瓶，并1：100 添加丁酸鈉（NaBu），37°C，8%CO2 培養(yǎng)箱內搖床培養(yǎng)；電轉后24h，按要求添加補料，并將細胞樣品轉移到32°C，8%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，d3、d5再次添加補料。具體電轉后處理方式，詳見表4。
表3 ExpiCHO-S細胞電轉抗體表達載體參數
NO. | System | Density (cells/ ml) | Buffer | Plasmid | Plasmid Concentration (μg/ml) | Voltage (V) | Duration (μs) | Pulse No. | Interval (ms) | Flow rate (ml/min) | Buffer Volume (ml) | 電轉后培養(yǎng)體積 |
1 | F1 | 1×108 | EBEL | 質粒A | 100
| 200 | 2000 | 4.5 | 611 | 4.71 | 4 | 約60-80ml |
2 | F1 | 1×108 | EBEL | 質粒B | 100 | 200 | 2000 | 4.5 | 611 | 4.71 | 4 | 約60-80ml |
3 | F1 | 1×108 | EBEL | 壹達hIgG | 100 | 200 | 2000 | 4.5 | 611 | 4.71 | 4 | 約60-80ml |
備注：本輪實驗培養(yǎng)電轉后，客戶電轉后培養(yǎng)總體積大約XX ml×4×106/ml(具體按照細胞實際得率而定)。
按照表4進行添加補料，電轉后37°C培養(yǎng)，24h后轉移至32°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
為了更好的監(jiān)測細胞培養(yǎng)狀態(tài)，以及抗體積累趨勢，建議D3開始每天進行細胞密度和活率監(jiān)測，并留樣品進行蛋白檢測。如有條件，可以同時監(jiān)測細胞葡萄糖含量以及乳酸代謝。ExpiCHO-S細胞活率低于70%以下，建議離心獲得蛋白樣品。
表4 ExpiCHO-S細胞F1電轉補料方案
NO. | Plasmid | Culture density（/ml） | Culture volume（/ml） | Culture medium | D0 | D1 | D3 | D5 | D7、D9 …… |
1 | 質粒A | 4×106 | 約60-80ml | CD04 | ①電轉后1：100加入NaBu ②37°C培養(yǎng) | ①壹達補料 ②32°C培養(yǎng) | ①壹達補料 ②32°C培養(yǎng) | ①壹達補料 ②32°C培養(yǎng) | ①壹達補料 ②32°C培養(yǎng) |
2 | 質粒B | 4×106 | 約60-80ml | CD04 | |||||
3 | hIgG質粒 | 4×106 | 約60-80ml | CD04 |
注：表4中培養(yǎng)體積僅為預判體積，實際培養(yǎng)體積由電轉后活細胞實際得率而定。以上補料添加時間段參考壹達補料方案。
電轉后24h，壹達實驗組即d1天開始添加客戶補料，電轉后24h轉移至32°C搖床培養(yǎng)；且在d3和d5天按照d1方式再加入補料培養(yǎng)；d1-d7培養(yǎng)過程中，均需取樣進行臺盼藍染色計數，并收集1ml細胞懸液，12000rpm 5min離心獲得蛋白樣品。
三、實驗步驟（參見壹達SOP《 RD-WI-02-045 懸浮型CHO-S細胞F1電轉染標準操作流程A0》）
1、開機檢測與設置電轉參數：打開F1的電源鍵及開關鍵，儀器自檢無誤后，設置電轉參數，電壓200V，脈寬2000μs，電極次數4.5次，時間間隔611ms，流速4.71ml/min，設置搖擺，備用。
2、細胞觀察：從培養(yǎng)箱中取出細胞搖瓶，立即取出100μl于96孔板中靜置5min觀察細胞形態(tài)，是否污染。（主要判斷是否污染）
3、細胞計數：將細胞搖瓶用10ml移液器吹打混勻5次，取100μl細胞懸液加入100μl或者200μl 1× PBS稀釋混勻，取10μl的細胞原液加入10μl 臺盼藍染色，即1：4或1：6稀釋，混勻靜置3min，取10μl使用血球計數板進行計數。若有儀器直接按照儀器計數方法進行。
4、收集細胞、離心棄去培養(yǎng)基：取所需數量細胞，移至離心管內300g，5min進行離心，棄上清。（如Eppendorf離心機50ml適配器，盡可能的去除培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)基導電性過高，殘留較多會影響電轉Buffer的導電性，導致結果不穩(wěn)定。）
5、DNA、細胞、buffer混合：使用移液器棄去上清，加入相應體積的EL buffer(如計劃電轉7ml，則加入7ml EBEL buffer )，再加入相應體積的質粒，使用移液器吹打10-12次使得質粒、buffer、細胞完全混勻；注意移液器吹打細胞過程中，切忌產生大量氣泡，如果不小心產生大量氣泡，請將不含氣泡的液體轉移至新的離心管中或者用移液器小心吸去氣泡，連接F1電極耗材。（若質粒來源不清楚，建議加質粒加入到buffer液中，通過0.22μm濾膜過濾，然后再加入到細胞中，以保證無菌。）
6、安裝電極：按照以下示意圖將電轉耗材由左到右安裝至電轉儀相應位置；
（安裝耗材時按照下圖方式進行連接。濾器位置不宜太靠僅黑色面板，以防電轉過程中，搖擺導致刮花面板。）
注意液位感應處上下兩個膠粒固定好位置；注意蠕動泵左右兩個膠粒固定好位置
7、核對參數、電轉：核對電轉參數：電壓200V，脈寬2000μs，電極次數4.5次，時間間隔611ms，流速4.71ml/min，開始電擊。
8、處理耗材：電轉后從右至左依次取下電轉耗材，將耗材表面噴灑精處理后，移至生物安全柜，將收集管用自身的管蓋擰緊。
9、孵育：將收集管置于37℃培養(yǎng)箱靜置孵育20min。（若收樣的離心管中還有空間，可添加適量CD04完全培養(yǎng)基后進行孵育，不要吹打混勻；如7ml收樣體積+5mlCD04培養(yǎng)基孵育。此步驟要輕柔，電轉后細胞比較脆弱。）
10、接種處理：孵育完成后，取出收集管，將細胞吹打均勻，臺盼藍染色計數（若電轉密度為1×108/ml，建議至少稀釋40倍），以活細胞密度為4×106/ml進行接種培養(yǎng)。
（一般電轉后的細胞得率在60-80%之間，如5*10^8細胞總量，電轉后實際細胞量可能在3.0-4.0*10^8，預判細胞培養(yǎng)體積為75-100ml；因此可以將上述收樣管中細胞直接轉移至70ml培養(yǎng)體積中，再進行細胞計數。最后根據4*10^6密度補足培養(yǎng)體積即可。）
11、細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)基中加入1mM NaBu，置于37℃ 8%CO2培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)，并在24h后將細胞轉移到32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（除了添加Nabu，CD04培養(yǎng)基需要添加4mM谷氨酰胺。）
12、補料添加：在電轉后的第1、3、5天按照5% 2×103A+1% BR7添加補料。（若細胞需要培養(yǎng)更長時間，可在第7、9天按照7.5% 2×103A+1% BR7進行添加，在第11天按照5% 2×103A+1% BR7添加補料）。
（電轉后24h，即D1開始需要持續(xù)降溫培養(yǎng)32°C，8%CO2，同時添加補料。建議D1開始監(jiān)測葡萄糖含量以及乳酸代謝；D3開始監(jiān)測細胞密度與活率；D5開始每天留樣。）
四、實驗結果
（用于結果跟進記錄，不限定具體形式/格式）
報告撰寫人 |
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審批 | 審核 |
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批準 | ||
備注：
ExpiCHO-S細胞復蘇步驟：
1、從液氮中取出細胞，在37℃的水浴中旋轉融化1-2min，迅速融化細胞，直到只剩下少量的冰。不要將細胞管浸入水中。
2、在細胞完全解凍之前，先用70%乙醇擦拭管子，然后在超凈臺中打開。
3、可以預準備9ml培養(yǎng)基，然后將融化后的細胞轉移到其中，混勻后臺盼藍染色計數，以活細胞密度3e5/ml接種。
Note：1E7/支細胞株根據細胞得率一般可以培養(yǎng)25-30ml。
4、將細胞置于37℃，濕度 ≥ 80%，8% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
Note：搖床轉速設為125±5rpm，振幅設為19mm；轉速120±5rpm時，振幅為25mm；轉速為95±5rpm時，振幅為 50mm。
5、復蘇后第三天，測定細胞密度以及存活率，細胞存活率應 ≥ 90%，后續(xù)培養(yǎng)細胞活率恢復至95%以上。
6、當細胞密度達到4×106-6×106/ml時，將細胞傳代（一般在復蘇后3-4天）
二、電轉前客戶細胞準備階段：
2.1 ExpiCHO-S?表達培養(yǎng)基培養(yǎng)要求：
①ExpiCHO-S? 細胞可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，細胞倍增時間：17-18h。
②該細胞具有廣泛的細胞對數期（4×106-15×106/ml），對數期細胞活力應保持在95%以上，此外，該細胞的最高培養(yǎng)密度可達到20×106/ml。
上圖摘自ExpiCHO-S細胞培養(yǎng)說明書
③建議活細胞初始接種密度保持在0.2×106-0.3×106/ml，可保持3天的培養(yǎng)時間，密度大概達到4×106-6×106/ml時，再將細胞傳代。
活細胞初始接種密度保持在0.15×106-0.2×106/ml，可保持4天的培養(yǎng)時間，密度大概達到4×106-6×106/ml時，再將細胞傳代。
建議細胞密度達到4×106-6×106/ml時，再將細胞傳代。（電轉前細胞密度建議同樣保持4×106-6×106/ml，細胞活力95%以上）
④培養(yǎng)箱條件：將細胞置于37°C，濕度≥ 80%，8% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
Note：搖床轉速設為125±5rpm，振幅設為19mm；轉速120±5rpm時，振幅為25mm；轉速為95±5rpm時，振幅為50mm。
Note：如果細胞傳代密度在早期對數生長周期之外，可能會導致細胞倍增周期延長以及更低的滴度。調整初始接種密度從而使細胞在傳代時的密度為4×106-6×106/ml。
Note：對于常規(guī)的在125ml-2L 培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)細胞，搖床轉速設為125±5rpm，振幅為19mm；轉速120±5rpm時，振幅為25mm；轉速為95±5rpm時，振幅為50mm。
Note：對于3L的培養(yǎng)瓶，設置轉速為90±5 rpm，振幅為19mm，轉速為85±5rpm時，振幅為25mm，轉速為80±5rpm時，振幅為50mm。
2.2 國產培養(yǎng)基培養(yǎng)要求：
①若客戶僅用國產培養(yǎng)基，進行ExpiCHO-S細胞傳代培養(yǎng)，建議初始接種密度0.3-0.5×106，可維持2-3天的培養(yǎng)時間，細胞密度建議不超過6×106/ml，再將細胞傳代。（電轉前細胞密度建議同樣保持3-6×106/ml，細胞活力95%以上）
②細胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)參數，以及轉速，振幅等同樣參考上述ExpiCHO說明書中要求。
2、電轉后實驗準備階段：
電轉后無論ExpiCHO表達培養(yǎng)基或是國產培養(yǎng)基培養(yǎng)的ExpiCHO-S細胞，均要求4×106/ml密度進行培養(yǎng)，D0添加丁酸鈉抑制劑；D1、D3、D5……間隔添加補料，且根據細胞狀態(tài)一般建議D7-D10進行細胞收養(yǎng)檢測蛋白量，期間不用再添加培養(yǎng)基。
