酵母蛋白表達
酵母蛋白表達步驟/實驗流程
本文主要講述了酵母蛋白表達步驟，詳細酵母表達流程。從感受態細胞制備，轉化方法選擇及操作，從化學試劑PEG1000 轉化，電擊轉化，原生質體法轉化三個方法入手及轉化子的篩選及最終的蛋白表達，全套酵母蛋白表達標準操作流程。
質粒線性化
在酵母表達系統中已經介紹了酵母蛋白表達原理，因此線性化是酵母轉化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。
轉化方法
轉化方法 | 轉化效率 | 是否會多拷貝整合 | 操作 |
原生質體法 | 105 | 是 | 操作復雜 |
電穿孔法（電擊） | 105 | 是 | 操作方便 |
PEG 誘導轉化 | 105 | 否 | 操作方便 |
畢赤酵母PEG1000 轉化及感受態制備
配置緩沖液
1）緩沖液 A：1.0M 山梨醇，10mM 甘氨酸，pH8.35，3%（v/v）乙二醇，濾膜過濾，-20℃保存；
2）緩沖液 B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，濾膜過濾，-20℃保存；
3）緩沖液 C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，濾膜過濾，-20℃保存；
4）未污染的新鮮、試劑級 DMSO，-70℃保存
將 DNA 直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處（即使在冰上解凍的待轉化細胞，其攝取外源 DNA 的能力也在解凍過程中迅速下降；樣品的轉化，進行多組試驗。
感受態制備
1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板（YPD：蛋白表達試劑配置），30℃培養 2 天；
2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）過夜培養后按 1%左右的接種量接種到 100mlYPD 培養基中震蕩培養至 OD 值從 0.1 至 0.5~0.8；
4）3000~5000rpm 離心收集沉淀菌體，用 50ml 預冷 A 液洗滌，并重懸與 4mlA 液中；
5）根據每次使用量（0.1-0.2ml 左右）分裝與 1.5ml 離心管中，每管加入 10ul 的預冷 DMSO，混合后迅速-80℃
/液氮（感受態可以放到-80℃ ，但是酵母表達建議感受態現做現用）
酵母轉化
1）線性化質粒 50ug（可預冷）溶于 200ul 的 TE 中，直接加入凍存的酵母感受態中；
2）37℃水浴 5min，過程混合樣品 2 次；
3）取出加入 1.5ml 緩沖液 B，徹底混勻；
4）30℃水浴 1 小時；
5）室溫 2000rpm 離心 10min，去上清，得沉淀，重懸菌體與 1.5ml 緩沖液 C 中；
6）再次離心，去上清，得沉淀，輕輕加入 0.2ml 緩沖液 C 重懸；
7）將重懸的轉化液涂與選擇性培養基（根據抗性配置）中，30℃孵育 3-4 天，進行鑒定。
畢赤酵母電擊感受態細胞制備及轉化
感受態制備
1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板，30℃培養 2 天；
2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）過夜培養后按 1%左右的接種量接種到 100mlYPD 培養基中震蕩培養至 OD 值 1.2~1.5；
4）4℃，5000rpm 離心 5min 收集沉淀菌體，用 100ml 預冷無菌水重懸菌體；
5）4℃，5000rpm 離心 10min 收集沉淀菌體，用 100ml 預冷無菌水重懸菌體；
6）再次 4℃，5000rpm 離心 10min 收集沉淀菌體，用 100ml 預冷無菌水重懸菌體；
7）20ml，1mol/L 山梨醇洗滌 1 次；
8）將菌體溶于 200ul，1mol/L 預冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置幾小時，待轉化
酵母電轉
1）準備好 80ul 的酵母感受態與線性化的質粒 1-5ug（冰上預冷 15min）混合，迅速放入 0.2cm 的電擊杯中（電擊杯冰上預冷滅菌），電擊；
2）電擊結束，迅速加入 1ml 山梨醇，涂平板（在搖床上培養 1h 后涂平板也可）；
3）MD 培養基生長 3-4 天，ROB 培養基上生長 4-5 天后，鑒定。
?電擊注意點
1）線性化質粒的含量在 1-5ug，純度越高越好，量要有保證，很多人找不到陽性轉化子可以考慮是否是這個因素造成；
2）感受態菌液收集，確定 OD 值在 1.2-1.5 之間，可以稀釋不同倍數，判斷是否是線性關系，菌液渾濁單 OD 值不高，可能是OD 稀釋倍數不夠；
3）感受態保存，感受態制備但其他還沒處理好，冰上放置的時間對轉化效率也會有影響，因此還是那個原則：現做現用；且分裝成每次夠用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染； 4）電擊杯清洗，先洗凈吹干，浸泡在 75%乙醇中，使用前超凈臺紫外滅菌，重復使用對實驗也會有一定影響；
5）電擊參數，電壓及電擊時間可以摸索，適當增加電壓或延長電擊時間，電擊過程冰上操作
畢赤酵母原生質體法轉化及感受態制備
原生質轉化原理
酵母細胞具有細胞壁，細胞壁會組織其對外源 DNA 的攝入，因此，去除掉部分的細胞壁有利于酵母細胞對 DNA 的吸收。利用藤黃節桿菌酶（為一種葡聚糖酶），可以部分消化細胞壁。關鍵在于不能過度的消化細胞壁，否則將造成細胞死亡。藤黃節桿菌酶的消化能力受到 SDS 的影響，可以加入 SDS 對其消化進行控制，以得到消化適度的細胞。消化獲得 70%的原生質細胞時，效果最好。
試劑配制
轉化當天，配制如下溶液：
① SE：1M 山梨醇，25mM EDTA，pH8.0
② SCE：SE：1M 山梨醇，1mM EDTA，10mM 檸檬酸鈉緩沖液，pH8.5
③ SOS：1M 山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl2
④ CaS：1M 山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2
⑤ DTT，PEG：DTT 水配制為 1M 濃度，PEG 用水配制 40%（w/v）
⑥ CaT：20mM Tris pH7.5，20mM CaCl2
⑦ 藤黃節桿菌酶：用水配制成 3mg/ml 的濃度
⑧ 5%SDS 溶液，RD 融化瓊脂 100ml，1M 山梨醇每次轉化時配制
① SED：19ml LSE 加 1ml DTT
② PEG/Cat：1:1 混合 40%PEG 及Cat 其他試劑
① YPD 培養基 1L，YPD 平板 1L
② RDB 平板 1L，RDHB 平板 1L
感受態制備及消化細胞壁
1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板，30℃培養 2 天；
2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）取培養的細胞 5ul，10ul，20ul 分別加入到含有 200mlLYPD 的液體培養基中，30℃震蕩過夜（300rpm）；
4）第二天測每個培養瓶中的 OD600 值，并取出事先配置好的轉化溶液，室溫放置：
5）收集 OD600 值在 0.2-0.3 對應的培養瓶中的細胞，室溫離心（1500rpm5min 左右），得到沉淀；如果沒有培養瓶中的 OD 值在 0.3 左右的話，選擇一個培養瓶，用新配置的培養基以 1：4 稀釋，再次培養（2-3h 左右），直至出現OD 值為 0.2-0.3，收集細胞；
6）準備去除細胞壁，準備去壁試劑和待去壁的細胞；
7）準備去壁試劑：現配 SED，保證DTT（分析級）的新鮮度，配完放-20℃；
8）準備帶去壁細胞：先用滅菌水清洗，轉入離心管；1500rpm 離心 5min，收集細胞，用 20mlSED 重懸并洗滌離心；再次用 1M 山梨醇洗滌，離心（同上）；用SCE 重懸，分開至兩個離心管中（每管 10ml 左右）；
9）準備藤黃節桿菌酶，取一管酶放置冰上，以上準備的兩管細胞取出一管加入藤黃節桿菌酶，開始消化細胞（這一步可確定酶消化的最佳時間）；
最佳時間的確定
① 準備 20ml 5%SDS 溶液分光光度計調至 800nm，空白對照為 800ul 5% SDS 及 200ul SCE；
② 準備 10 個離心管，編號為 0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50（根據時間編號）；
③ 取上述 8 步中的另一管細胞，取出 200ul 加入至 0 號管中，放置冰上，此為 0 點；
④ 加入 7.5ul 藤黃節桿菌酶在剩余的細胞中，輕混，30℃孵育（不要晃動）用來建立最佳時間所用
⑤ 2min 時取 200ul 懸浮液至 2 號管中，同理 4，5，6，7，8min 時重復操作，讀樣品 OD800 值；
⑥ 用公式計算細胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T 時間 OD800-0 時間 OD800 值）x100} 10）計算出去壁率為 70%左右時，得出最佳消化時間，同樣操作加入 7.5ul 消化酶于另一管中消化細胞
11）室溫離心去除懸浮液，1M 山梨醇洗滌一次，0.6mlCaS 懸浮細胞，立即轉化，去壁的細胞應立即轉化。
轉化畢赤酵母
1）取 100ul 將去壁細胞，放入 1.5ml 離心管中（滅菌）；
2）準備 10ug 線性化質粒（預冷）與去壁細胞混合，加入 1ml 新鮮 PEG/Cat 溶液，輕混，室溫孵育 10min；
3）室溫 750rpm 離心 10min，去除 PEG/Cat 溶液；并用 150ulSOS 培養基懸浮轉化細胞，室溫孵育 20min；
4）加入 800ul 1M 山梨醇，涂平板；
5）取 200ul 轉化細胞和 RD（液體）混勻倒于 RDB 平板上，凝固后導致平板，30℃培養 4-6 天，出現轉化子；
6）取 100ul 稀釋細胞，與 RDH（液體）混勻，涂在 RDHB 上，凝固后倒置生長，30℃培養 4-6 天，出現克隆， 表明去壁細胞可再次生長為分裂細胞。
陽性轉化子的篩選與蛋白表達
Mut+和 Muts 表型的判斷
待轉化子在平板上生長一段時間后，進行 Mut+和 Muts 的篩選。挑取單克隆，在 MM 及 MD 培養基上劃線或點（先在MM 平板上點，再在 MD 平板上點，一個克隆換一次牙簽），30℃培養 2 天。觀察，在MD 培養基上生長而在MM 培養基上不生長或長的很小即為 Muts 表型，其余為 Mut+表型。
Mut+的誘導表達
1）挑取單菌落，搖菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培養基中，30℃，300rpm 培養至 OD600 為 2-6（培養
15-18h 左右觀察）；
2）室溫 2000rpm 離心 5min，收集菌體，用上述培養基重懸，使 OD600 為 1.0 左右；將菌液至于 1L 搖瓶中，
30℃300rpm 培養，每 24 小時加入 100%甲醇，至終濃度為 0.5-1.0%；
3）根據時間點取樣（1ml）至于 1.5ml 離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達量和最佳收獲時間；
4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 進行分析鑒定表達情況。
Muts 的誘導表達
1）挑取單菌落，搖菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培養基中，30℃，300rpm 培養至 OD600 為 2-6（培養
15-18h 左右觀察）；
2）室溫 2000rpm 離心 5min，收集菌體，用上述培養基重懸，使 OD600 為 1.0 左右；將菌液至于 1L 搖瓶中，
30℃300rpm 培養，每 24 小時加入 100%甲醇，至終濃度為 0.5-1.0%；
3）根據時間點取樣（1ml）至于 1.5ml 離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達量和最佳收獲時間；
4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 進行分析鑒定表達情況。
酵母表達原理
本文主要講述了畢赤酵母蛋白表達的原理，畢赤酵母表達能夠高效表達的機制。
巴斯德畢赤酵母（以下簡稱畢赤酵母）能夠高效表達外源基因，是因為其有更強的強啟動子，即醇氧化酶啟動子PAOX。甲醇營養型酵母能將甲醇分解為甲醛和過氧化氫，在此反應中參與的酶是醇氧化酶（AOX1 和 AOX2）。其中，AOX2 的表達量比 AOX1 低得多，以甲醇為唯一碳源時，AOX1 增至細胞總蛋白的 40%。PAOX1 受甲醇誘導和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1 的表達受到甲醇的嚴格控制。
巴斯德畢赤酵母所表達的外源基因位于酵母染色體上，這是通過把攜帶外源基因的表達質粒線性化，以同源重組的 方式整合到強啟動子 PAOX1 的下游，目的基因一般插入到 5’AOX1 啟動子和轉錄終止子之間的單克隆位點。
畢赤酵母蛋白表達系統
1. 酵母表達宿主菌Mut+和 Muts
在畢赤酵母表達系統中，乙醇氧化酶有兩種基因編碼，即 AOX1 和 AOX2。細胞中絕大多數乙醇氧化酶活力有 AOX1 提供，菌株利用甲醇的速度主要由 AOX1 基因表達的 AOX1 蛋白提供。當 AOX1 缺失，只存在 AOX2 時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，這種細胞利用甲醇能力低，在甲醇培養基上生長緩慢的菌株表現型為 Muts。存在 AOX1， 細胞利用甲醇正常生長，在甲醇培養基上生長較快，這種菌株表現型為 Mut+，這就是甲醇營養型畢赤酵母表達兩種 Muts 和 Mut+產生的原理。
?酵母表達系統常用宿主菌
GS115、KM71、SMD1168 是常用的表達宿主菌，均為甲醇誘導型。他們都是組氨酸缺陷型，如果表達載體上帶有組氨酸基因，可以補償宿主菌的組氨酸缺陷，所以可以在不含組氨酸的培養基上篩選重組轉化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養基上生長時，AOX1 基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時，宿主菌的 AOX1 基因被強烈誘導，使目的基因大量表達。
?有無甲醇誘導產生的 Mut+和 Muts 表現型
畢赤酵母的最適生長溫度為 28-30℃，誘導期間超過 32℃，不利于蛋白表達，并可能導致細胞死亡。Muts 和 Mut+ 菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率一樣，存在甲醇的情況下，AOX1 啟動子被強烈誘導，Mut+較 Muts 生長更快（4-5 倍）。
1. 酵母蛋白表達載體
酵母蛋白表達載體的選擇
酵母表達產物有胞內表達和分泌到胞外表達兩種方式，這取決于表達載體的選擇和構建是否帶有信號肽，可根據基 因表達的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達載體。
① 胞內表達載體：主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。該類載體將目的基因表達在胞內，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達水平高但純化相對復雜。
② 分泌到胞外表達的載體：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號序列由 89 個氨基酸組成α交配因子的引導。
③ 多拷貝插入表達載體：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達量。
表達重組蛋白使其具體天然的 N 端
想實現表達重組蛋白使其具體天然的 N 端，將目的基因直接連接在 Kex2 蛋白酶切位點之后。Kex2 蛋白酶切位點在信號肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置為 Kex2 蛋白酶的酶切位點
畢赤酵母表達系統機制/原理
畢赤酵母能夠高效的表達外源基因，是因為其具有強啟動子乙醇氧化酶啟動子（AOX1 和 AOX2）。AOX1 和 AOX2 及其產生的 Muts 和 Mut+表現型前文已經敘述過。AOX1 受甲醇的誘導和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達的外源基因位于酵母染色體上，通過把構建的質粒/載體線性化（主要采用酶切），通過同源重組的方式整合到啟動子 AOX 的下游，一般是插入到 5’AOX 啟動子和轉錄終止子信號之間的單克隆位點。
