天然藥物反向尋靶系統
《天然小分子化合物反向尋靶報告》
1 目的
針對客戶提供的1個化合物進行反向虛擬篩選，結果返回給客戶。
2 材料與方法
2.1 反向虛擬篩選材料
客戶提供的1個化合物見表 1。
表1.客戶提供的五個化合物
2.2 反向虛擬篩選流程
對接軟件：Glide或者Vina軟件。
方法：基于受體的反向虛擬篩選方法基于分子對接原理，將小分子化合物一一對接到靶標數據庫的靶標活性位點上，根據化合物-靶標的結合能大小打分排序，結合能越低，排名越前，潛在靶標的可能性越大。
蛋白對接篩選庫：我們針對Scpdb數據庫，并結合我們自行研發的反向虛擬篩選數據庫，利用對接軟件進行反向虛擬對接篩選，蛋白質數據庫共計23456種類蛋白質。該蛋白質數據庫整合了目前RCSB PDB數據庫中所有已知晶體蛋白結構類型數據，具有最為全面的蛋白結構數據信息。對1個化合物分別提交反向虛擬篩選任務并返回前500個分子對接結果。 |
3 結果與分析
每個化合物結果文件包括得分排名前500 對接文件信息，對接得分排序的前500個結果見列表Top_Target_500.csv 文件，我們挑選其中前50名小分子進行重點分析，如下表所示：
挑選能量最好、聚類最多的小分子位相用于結果分析。
以 compound1-Whole庫反向虛擬篩選排名第一的靶標結果為例，簡要介紹如何通過靶標信息分析和結合模式分析來查看反向虛擬篩選結果。compound1 排名第一的靶標為Cytochrome P450 11B2, mitochondrial[Homo sapiens]（第一列），靶標蛋白質文件為4dvq_1CA_10_[J]（第三列，意思是PDBID:4dvq，結晶結構配體名稱1CA，chain ID：J鏈）。在篩選時，如果篩選的目標蛋白為人源蛋白，非篩選的蛋白為其他物種來源，則需要考慮其他物種來源蛋白與人員蛋白的序列同源性，否則可以直接放棄此靶標。
3.2.1 靶標信息分析
Compound1 排名第一的靶標為 cyclin-dependent kinase 2 isoform 1 [Homo sapiens]， 靶標相關信息在Top_Target_500.csv 文件，詳細介紹可參考幫助文檔 http://reversedock.vslead.com/index.php?r=site/help。通過對已知化合物的藥理活性、治療領域的了解，結合 Top_Target_500.csv文件中的靶標UNP_AC（第四列）數據，去對應UniProt數據庫搜索更全面靶標信息，最終確定化合物的潛在作用靶標。
3.2.2 化合物和靶標蛋白結合模式分析
compound1排名第一的結果文件為4dvq_10_1CA.pdbqt 和4dvq_10_1CA.log。4dvq_10_1CA.log為化合物對接后構象得分。分析4dvq_10_1CA.pdbqt化合物對接后構象，可用可視化軟件（如 Pymol，如Pymol打開有問題顯示化合物鍵有問題，可用Discovery Studio）打開，結合蛋白質三維結構（此處為 PDBID: 4dvq，在http://www.rcsb.org/下載即可），分析化合物-蛋白質結合模式（圖2）和靜電表面結合情況（圖3）
圖2 結合模式圖 A) 晶體結構pdb:4dvq 結合模式圖； B)compound1 與 pdb:4dvq結合模式圖
圖3靜電表面圖晶體結PDB:4DVQ ，棍狀化合物分別為配體1CA(green)和COM1（cartoon）。
該部分為前期數據結束以后，客戶最廣泛要做的業務，在此提供僅供參考
4 基于鑒定蛋白的藥物分子設計與化學修飾
計算機輔助藥物設計
在鑒定所得蛋白質三維結構基礎上，徹底分析了XYZ蛋白結合口袋周圍理化性質，報告如下：（a）突變前：小分子包圍在疏水口袋，親水氨基酸R125、E154與其形成氫鍵鉚釘作用，使其牢牢穩固在蛋白質中；（a）突變后：疏水環境大致不變，但氨基酸N125、I154造成很大空隙，親水性轉換為疏水口袋，穩定性降低。
分子動力學方法
利用分子動力學方法對XYZ蛋白突變后與小分子Hormone間相互作用狀況進行了計算模擬分析，以期得到蛋白質在突變后的小分子結合信息。
（a）突變后XYZ蛋白Region A區域沒有變化，對該部分不做任何修改； （b）Region B區域中，小分子下方出現巨大空洞，需要對該部分進行補漏； （c）Region B區域巨大空襲，在小分子穩定結合時，下方出現由10~13個水分子組成的“水氫鍵網絡體系”； （d）“水氫鍵網絡體系”中，水分子能量Energy（球體大小）和占有率Occupancy（球體顏色）均能表達出蛋白質局部區域理化性質。 具體總結為：Region B區域絕大多數水分子能量Energy極小、占有率Occupancy較小，說明該區域極為疏水；但其中W1水分子，能量較好、占有率較高，說明W1水分子極為穩定，周圍氨基酸為極親水性氨基酸，將來可以通過替換W1水分子或通過橋鍵作用對其進行化學修飾 |
基于體內原生激素Hormone的藥物設計
化學片段增長設計法
基于分子動力學模擬結果，基于W1水分子相關信息，對Region B區域進行了化學片段結構設計。首先設計的化學片段，將能夠有效的到達W1水分子附近，或將其替換掉。共設計母核結構50枚，且均具備有機合成實驗方法實現的可能性。
分子對接方法判定最佳化學母核結構
利用分子對接方法，將50枚母核結構分別對接進入突變后蛋白質XYZ結構中，利用分子對接權重值，判定3枚小分子藥物在對接結果中占據較好的權重位置。采用C2、C1和C3進行后期化學結構改造。
新型母核結構修飾，分子再對接
對C2~3三類化合物進行化學片段化結構修飾。尤其以第2類C2化合物為重點研究對象。基于C2化合物，共設計化學片段78枚，而后再對這78枚新型化學分子進行Molecular docking操作，預測其結構屬性。
通過分子動力學模擬，計算蛋白質Protein與小分子Ligand之間的能量體系，將最有能量體系進行排名，得到前50位較好能量體系的小分子。
化學合成
得到化合物結構后，進行化學合成工作。
體外細胞活性實驗
（1）腫瘤細胞培養
（2）細胞活性實驗
細胞毒性、細胞遷移、活細胞成像、實時動態活細胞成像、非標記活細胞成像。
非常好的結果是：活性實驗良好，特別是C2-1等10個化合物對癌細胞的細胞活性數據IC50=45nm，具備極高的成藥潛在性。
動物腫瘤模型構建
成立生物活性實驗室，加速動物活體實驗。
將乳腺癌腫瘤細胞系，稀釋注射進入小白鼠、大白鼠、白兔和黑猩猩體內，成功得到動物體內腫瘤模型。
動物體內活性實驗
