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     等溫滴定量熱法 (ITC) 是用于量化研究各種生物分子相互作用的一種技術。 它可直接測量生物分子結合過程中釋放或吸收的熱量。
      ITC 可以測定結合配偶體在自然狀態下的親和力，無需通過熒光標記或固定化技術對結合配偶體進行修飾。
      通過測量結合過程中的熱傳遞，就能夠準確地確定結合常數 (KD)、反應化學量 (n)、焓 (?H) 和熵 (ΔS)。 這就提供了有關分子相互作用的完整熱力學信息。 ITC 不僅可測定結合親和力，還能闡明潛在分子相互作用的機制。
 

測量原理：
等溫滴定量熱法用來測定各生物分子之間的反應。 該方法可測定結合親和力、化學計量以及溶液中結合反應的熵和焓，無需使用標記。發生結合時，熱不是被吸收就是被釋放，這是在配體被逐漸滴定到包含目標生物分子的樣品池過程中通過靈敏量熱計而測得。
 

工作原理：

       熱核心

       微量熱計中有兩個池，其中一個含有水，作為參比池，另一個含有樣品。 微量熱計必須使這兩個池保持完全相同的溫度。 熱敏裝置檢測發生結合時兩個池之間的溫差，并反饋給加熱器，由加熱器來補償該溫差并使兩個池恢復到相同的溫度。
進行測量

       參比池和樣品池被設定到所需的實驗溫度。 將配體裝入一個非常精確的注射裝置上的注射器中。 將注射裝置插入包含目標蛋白質的樣品池中。 將一系列小份配體試樣注入到蛋白質溶液中。 如果有配體與蛋白質結合，則可檢測到并測出幾百萬分之一攝氏度的熱量變化。進行第一次注射時，微量熱計測量被釋放的所有熱量，直到結合反應達到平衡。  測得的熱量與結合量成正比。
結果和數據分析

      在下面的示例中，反應是放熱的，這就意味著樣品池溫度高于參比池并由此導致信號出現下行波峰。 隨著兩個池的溫度恢復到同一水平，信號也回到其起點。 將第二小份配體試樣注入到樣品池中，同樣，微量熱計補償所檢測到小幅熱量變化。 配體與蛋白質之間的摩爾比隨著一系列配體試樣的注入而逐漸增加。 蛋白質越來越飽和，配體結合的次數越來越少，并且熱量變化開始減小，直到樣品池中的配體數量相對于蛋白質而言最終表現出過量為止，從而使反應朝飽和的方向進行。
 

       然后對每個峰的面積進行積分，并以配體與蛋白質的摩爾比作為橫坐標進行繪圖。 由此得出的等溫線可擬合至導出親和力 (KD) 的結合模型。 結合等溫線中心的摩爾比即為反應化學計量。 下圖給出了 1:1 結合反應的示例圖。
 

      焓 (ΔH) 也可通過等溫線直接導出，它表示每摩爾結合配體所釋放的熱量。 這就意味著一次 ITC 實驗就可提供豐富的結合反應信息，有助于理解相互作用的性質并探索熱力學驅動因素。

ITC 廣泛用于藥物發現和開發領域的以下方面：

1. 量化結合親和力

2. 候選藥物的選擇與優化

3. 測定熱力學特性和活性濃度

4. 作用機制表征

5. 在小分子藥物發現過程中確認預期結合靶標

6. 測定結合特異性和化學計量

7. 驗證從苗頭化合物到先導化合物演化過程中的 IC50 值和 EC50 值

8. 酶動力學測定