分子垂釣是一種從復(fù)雜樣品體系中尋找與已知生物分子相互作用的特定分子（如小分子、蛋白質(zhì)、或其他生物活性分子）的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生物學(xué)研究、中藥研究、活性藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。 表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種生物傳感分析技術(shù)，可用于研究活性分子與靶點(diǎn)的相互作用，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分辨率高、樣品消耗少、實(shí)時(shí)監(jiān)測等特點(diǎn)。在高通量藥物篩選、候選藥物親和力測定、抗原表位鑒定等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 近年來，基于SPR的分子垂釣技術(shù)越來越引起廣大科研工作者的興趣，該技術(shù)利用SPR的高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)，以及SPR儀器的實(shí)時(shí)監(jiān)測、自動(dòng)化進(jìn)樣和回收流程，并結(jié)合高分辨質(zhì)譜鑒定，不僅能用于從細(xì)胞裂解液中垂釣蛋白質(zhì)等生物大分子，也能用于從中藥提取液中垂釣小分子化合物。基于SPR的中藥小分子垂釣的基本原理是將一種已知生物分子（靶蛋白）偶聯(lián)在傳感芯片表面，再將包含潛在活性分子的復(fù)雜樣品溶液（中藥提取液）注入到傳感芯片，進(jìn)行SPR檢測和活性分子回收。 在進(jìn)樣過程中，復(fù)雜樣品溶液中的活性分子會(huì)和偶聯(lián)在傳感芯片上的生物分子發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合可能是特異性或非特異性，致使芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生變化。進(jìn)樣結(jié)束后，繼續(xù)注入緩沖液使未結(jié)合或弱結(jié)合的成分離開芯片表面，而強(qiáng)結(jié)合的成分留在芯片表面。接下來，為了避免管路中的復(fù)雜樣品溶液混入后續(xù)回收的結(jié)合成分中，通過注入洗滌液清洗從樣品到芯片表面之間的管路，去除管路中的復(fù)雜樣品溶液。然后再注入洗脫液并孵育適當(dāng)時(shí)間，使芯片表面上結(jié)合的小分子解離下來。最后將液體流向反轉(zhuǎn)，使解離下來的樣品原路返回并收集在樣品溶解液中。 由于一次僅可回收微量樣品（2μL），可多次循環(huán)上述過程（一般10-20次），回收足夠量的樣品，合并后濃縮，用于后續(xù)質(zhì)譜鑒定，最終發(fā)現(xiàn)復(fù)雜樣品中的活性分子。 基于SPR的分子垂釣的基本流程 二、垂釣實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和技巧 理解基于SPR的分子垂釣的原理是實(shí)驗(yàn)成功的第一步，在實(shí)際操作中還需要特別關(guān)注以下方面，這些將直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 為了盡可能多回收活性成分，靶蛋白的高偶聯(lián)量是至關(guān)重要的。一般首選CM5傳感芯片通過-COOH與蛋白的-NH2發(fā)生反應(yīng)，偶聯(lián)效率較高，偶聯(lián)水平可到達(dá)10000-20000 RU。對(duì)于不易提取純化的跨膜蛋白，可選用L1 傳感芯片，其表面可捕獲囊泡和脂質(zhì)體。另外還有SA傳感芯片，其表面固定了鏈酶親和素，可特異性偶聯(lián)帶有生物素標(biāo)記的蛋白、多肽、核酸等。 在垂釣實(shí)驗(yàn)前應(yīng)驗(yàn)證偶聯(lián)后靶蛋白的活性和特異性，這一驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可以通過對(duì)特異性抗體/抗原或已知的活性分子進(jìn)行親和力測定，以確認(rèn)傳感芯片上靶蛋白的結(jié)合活性，有助于提高垂釣結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 在復(fù)雜樣品的“進(jìn)樣-回收”過程中，應(yīng)注意維持適當(dāng)?shù)木彌_液條件，以提高回收效率。運(yùn)行緩沖液和樣品稀釋液一般為PBS或EP；樣品回收液一般為弱酸（三氟醋酸、甲酸、乙酸）、弱堿（NaOH）、表面活性劑（吐溫20）、高鹽溶液（NaCl）；樣品溶解液一般為質(zhì)譜兼容的揮發(fā)性鹽溶液（NH4HCO3）。可采用已知的活性分子模擬篩選流程，以選擇最佳的緩沖液條件。 4．實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 盡量減少假陽性結(jié)果，是高質(zhì)量SPR垂釣實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志。為此，可通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：使用空白的CM5芯片重復(fù)垂釣過程，將回收到的樣品作為陰性對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜檢測，在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中作為背景對(duì)照扣除。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：鑒定出活性分子后，應(yīng)獲取其單體，采用SPR進(jìn)行親和力測定，以判斷結(jié)合的特異性。如果同時(shí)鑒定出多個(gè)活性分子，也可以對(duì)他們的動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較分析，從而排除假陽性結(jié)果。
