一、

二、

三、

1.高特異性：能精準(zhǔn)識(shí)別靶蛋白活性位點(diǎn)，避免非特異性結(jié)合。

2. 實(shí)時(shí)性：可在活細(xì)胞或生物體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)靶蛋白活性變化。

3. 全面性：能對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)新靶蛋白和潛在藥物靶點(diǎn)。

4. 應(yīng)用范圍廣：適用于多種生物體系和疾病模型。

四、

1. 藥物研發(fā)：在藥物開發(fā)中，ABPP釣靶技術(shù)可幫助篩選和優(yōu)化先導(dǎo)化合物，提高藥物療效與安全性。例如針對(duì)腫瘤細(xì)胞特定蛋白的活性檢測(cè)，開發(fā)出腫瘤靶向藥物。

2. 疾病診斷：利用該技術(shù)可對(duì)疾病相關(guān)蛋白進(jìn)行快速檢測(cè)與診斷。如在神經(jīng)退行性疾病中，通過檢測(cè)特定蛋白活性變化實(shí)現(xiàn)早期診斷與病情監(jiān)測(cè)。

3. 生物醫(yī)學(xué)研究：為研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)功能與作用機(jī)制提供重要手段。通過對(duì)不同生物體系中蛋白質(zhì)活性的分析，深入了解生命過程本質(zhì)。

五、

1. SPR配體垂釣：SPR技術(shù)（Surface Plasmon Resonance）基于表面等離子體共振現(xiàn)象，能實(shí)時(shí)、無標(biāo)記地檢測(cè)分子間相互作用，如抗原 - 抗體、藥物 - 靶標(biāo)蛋白、DNA - RNA等。基于此的配體垂釣技術(shù)，通過將藥物分子偶聯(lián)在芯片上，從總蛋白中釣取與藥物結(jié)合的蛋白。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

- 生物素化小分子固定：將生物素化的中藥單體通過鏈霉親和素偶聯(lián)到芯片上。

- 垂釣回收：將提取的細(xì)胞總蛋白混合物進(jìn)行垂釣回收。

- 質(zhì)譜檢測(cè)：利用質(zhì)譜技術(shù)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的成分差異，鑒定出潛在能與中藥單體結(jié)合的候選蛋白。

- 案例：暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院費(fèi)嘉教授團(tuán)隊(duì)通過SPR - MS技術(shù)鑒定小檗堿作用靶點(diǎn)UHRF1。該研究將小檗堿固定到傳感芯片上，加入細(xì)胞裂解液孵育，垂釣靶蛋白并回收，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，確定UHRF1為小檗堿的潛在作用靶點(diǎn)，并通過SPR和分子對(duì)接驗(yàn)證了相互作用。

2. CETSA - MS（TPP，熱蛋白質(zhì)組學(xué)）：CETSA技術(shù)基于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化，當(dāng)藥物分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合時(shí)，會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。CETSA - MS在此基礎(chǔ)上結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，對(duì)經(jīng)藥物及熱處理后的差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

- 細(xì)胞給藥處理：細(xì)胞給藥后進(jìn)行裂解。

- 加熱處理：離心后取上清裂解液進(jìn)行梯度或恒溫加熱（單一給藥使用梯度加熱、梯度給藥進(jìn)行恒溫加熱）。

- 離心去除沉淀：離心去除加熱變性沉淀的蛋白。

- 電泳與質(zhì)譜鑒定：將上清進(jìn)行SDS - PAGE電泳，對(duì)差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

- 案例：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院夏總平教授團(tuán)隊(duì)采用CETSA - MS技術(shù)鑒定槲皮素抗衰老靶點(diǎn)。該研究分別用DMSO和槲皮素處理HEK293T細(xì)胞，每組細(xì)胞懸液均分為12份，在特定溫度下進(jìn)行熱處理，然后細(xì)胞裂解，獲得上清液中的可溶性蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析。鑒定出CBR1、GSK3A和MAPK1為槲皮素的作用靶點(diǎn)，并通過CETSA和pull - down驗(yàn)證了相互作用。

3. ABPP（化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)）：基于活性的蛋白質(zhì)譜（ABPP）結(jié)合活性探針和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定活性小分子的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

- 探針制備：設(shè)計(jì)合成活性分子探針，并進(jìn)行活性鑒定。

- 孵育與結(jié)合：將探針與總蛋白孵育（或與細(xì)胞孵育后提取總蛋白）。

- UV照射與點(diǎn)擊反應(yīng)：孵育完成后，先后進(jìn)行UV照射（使活性分子與靶蛋白共價(jià)相連）、點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（給活性分子引入報(bào)告基團(tuán)，如生物素）。

- 靶蛋白富集鑒定：通過報(bào)告基團(tuán)對(duì)靶蛋白進(jìn)行富集鑒定（如通過鏈霉親和素磁珠分離生物素標(biāo)記的蛋白）。

- 蛋白質(zhì)組學(xué)分析：對(duì)收集到的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

- 案例：廈門大學(xué)林圣彩院士團(tuán)隊(duì)和鄧賢明團(tuán)隊(duì)基于化學(xué)探針法找到二甲雙胍的分子靶點(diǎn)——PEN2。該研究通過合成二甲雙胍的化學(xué)探針，對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行垂釣，經(jīng)質(zhì)譜等分析鑒定，結(jié)合DSC、SPR、ITC等技術(shù)確定二甲雙胍通過與PEN2蛋白的互作介導(dǎo)AMPK的激活。

4. DARTS - MS：DARTS（drug affinity responsive target stability - MS）利用小分子配體與靶蛋白結(jié)合后復(fù)合物穩(wěn)定性提高的特點(diǎn)，用蛋白酶處理樣品，通過SDS - PAGE比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異，再通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定差異條帶。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

- 細(xì)胞裂解：提取總蛋白（使用溫和裂解液，保持蛋白活性）。

- 孵育與對(duì)照：向總蛋白中添加藥物小分子孵育，同時(shí)對(duì)照加入等體積的實(shí)驗(yàn)組中溶解小分子的溶劑。

- 蛋白酶處理：向上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中分別加入等量蛋白酶孵育。

- 篩選鑒定：進(jìn)行SDS - PAGE或LC - MS篩選鑒定靶蛋白。

- 案例：重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院骨科超聲醫(yī)學(xué)與工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭風(fēng)勁教授、聶茂副教授及杜宇副主任醫(yī)師團(tuán)隊(duì)通過DARTS - MS鑒定人參三醇靶點(diǎn)。該研究將人參三醇和總蛋白孵育后加入嗜熱菌蛋白酶孵育，再加入PMSF終止蛋白酶水解，最后進(jìn)行SDS - PAGE，對(duì)差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定UFL1為人參三醇的潛在靶標(biāo)，并通過DARTS - WB、CETSA和分子對(duì)接驗(yàn)證了相互作用。

六、

ABPP釣靶技術(shù)在藥物研發(fā)、疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域具有重要意義。通過對(duì)不同技術(shù)的應(yīng)用，能夠更深入地了解中藥單體的作用機(jī)制，為藥物開發(fā)提供有力支持。未來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，ABPP釣靶技術(shù)將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步。