在藥物研發(fā)的漫長(zhǎng)征程中，精準(zhǔn)識(shí)別化合物的作用靶點(diǎn)是洞悉藥物作用機(jī)制、評(píng)估藥物療效與安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，傳統(tǒng)的化合物釣靶方法存在諸多弊端，諸如操作繁瑣復(fù)雜、成本居高不下，并且在標(biāo)記過(guò)程中可能會(huì)對(duì)生物分子的天然狀態(tài)造成干擾，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。CETSA技術(shù)的橫空出世，為解決這些難題開辟了新的路徑。該技術(shù)能夠在近乎生理的條件下，深入研究蛋白質(zhì)與小分子化合物之間的相互作用，為藥物研發(fā)以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

CETSA技術(shù)的原理

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)緊密相連。小分子化合物與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合常常會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)其熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。一般情況下，當(dāng)小分子與蛋白質(zhì)成功結(jié)合后，會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，在受熱環(huán)境中更不容易發(fā)生變性。這種因小分子結(jié)合而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化，成為了CETSA技術(shù)的核心檢測(cè)指標(biāo)。

CETSA技術(shù)的操作流程是先對(duì)細(xì)胞或組織勻漿進(jìn)行不同溫度梯度的熱處理，而后借助蛋白質(zhì)分析技術(shù)，如蛋白質(zhì)印跡法、質(zhì)譜技術(shù)等來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)在不同溫度條件下的含量或者豐度變化情況。倘若目標(biāo)蛋白質(zhì)與小分子化合物之間存在相互作用，那么在較高溫度下，相較于未結(jié)合小分子的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中該蛋白質(zhì)的含量下降幅度會(huì)相對(duì)較小，這種現(xiàn)象被稱為熱穩(wěn)定位移現(xiàn)象?？蒲腥藛T通過(guò)深入分析這種位移的程度和特征，就能夠判斷蛋白質(zhì)與小分子之間是否存在結(jié)合以及結(jié)合的緊密程度。

CETSA實(shí)驗(yàn)流程

首先，需要挑選合適的細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，并且要確保細(xì)胞始終處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。接著，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)組中加入待研究的小分子化合物，而對(duì)照組則加入等量的溶劑，比如DMSO?；衔锏奶幚頋舛纫约疤幚頃r(shí)間需要依據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，以此保證小分子能夠充分地與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。

對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心收集操作，隨后用緩沖液進(jìn)行重懸。把細(xì)胞懸液平均分成若干份，分別放置在不同溫度（一般設(shè)置范圍為37℃ - 65℃，溫度間隔為2 - 5℃）的水浴或者金屬浴中進(jìn)行熱處理，熱處理的時(shí)間通?？刂圃? - 10分鐘。熱處理結(jié)束后，要迅速將樣品放置在冰上冷卻，以此終止蛋白質(zhì)的變性過(guò)程。最后，通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)分析工作。

蛋白質(zhì)分析

從上述上清液中取出適量樣本，加入上樣緩沖液，接著進(jìn)行SDS - PAGE電泳，以此來(lái)分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相膜上，并用封閉液封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。隨后加入針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗，在4℃的環(huán)境下孵育過(guò)夜，使一抗與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。之后用洗滌緩沖液清洗膜，再加入相應(yīng)的二抗，在室溫下孵育1 - 2小時(shí)。最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)成像系統(tǒng)觀察并記錄不同溫度下目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶的強(qiáng)度，以此來(lái)分析其熱穩(wěn)定性的變化。

在大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用更為廣泛。將上清液中的蛋白質(zhì)提取出來(lái)并進(jìn)行酶解處理，從而得到肽段混合物。運(yùn)用液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用（LC - MS/MS）技術(shù)對(duì)肽段進(jìn)行分離和鑒定。通過(guò)分析不同溫度下目標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)肽段的豐度變化，來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于能夠同時(shí)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的潛在靶點(diǎn)具有重要意義。

運(yùn)用相關(guān)軟件，如ImageJ用于處理Western Blot數(shù)據(jù)，專業(yè)的質(zhì)譜分析軟件如MaxQuant等對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化分析。計(jì)算不同溫度下目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，并繪制蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性曲線。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的曲線，判斷蛋白質(zhì)與小分子化合物之間是否存在相互作用以及相互作用的強(qiáng)弱程度。

CETSA技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

在藥物研發(fā)的早期階段，CETSA技術(shù)可用于篩選小分子化合物的潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，找出那些與化合物結(jié)合后熱穩(wěn)定性發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)便是潛在的藥物作用靶點(diǎn)。后續(xù)通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，能夠確定這些靶點(diǎn)與藥物活性之間的關(guān)聯(lián)，為藥物研發(fā)指明清晰的方向。

明確藥物的作用機(jī)制對(duì)于優(yōu)化藥物設(shè)計(jì)以及開發(fā)全新的治療策略來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。CETSA技術(shù)能夠研究藥物作用后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性變化情況，從而揭示藥物所影響的信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程。例如，在抗癌藥物的研究中，通過(guò)分析藥物處理后癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性改變，能夠深入了解藥物是如何干擾癌細(xì)胞的增殖、凋亡等關(guān)鍵過(guò)程的。

藥物的安全性是臨床應(yīng)用中不容忽視的重要考量因素。CETSA技術(shù)可用于評(píng)估藥物的脫靶效應(yīng)，也就是藥物與非預(yù)期靶點(diǎn)的相互作用情況。通過(guò)對(duì)比藥物在正常細(xì)胞和病變細(xì)胞中的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性圖譜，找出在正常細(xì)胞中被藥物非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)而預(yù)測(cè)藥物可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

在基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域，CETSA技術(shù)可用于探究細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)與小分子，如代謝產(chǎn)物、信號(hào)分子等的相互作用。例如，在研究代謝物對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)，科研人員可以通過(guò)CETSA分析代謝物存在與否時(shí)酶的熱穩(wěn)定性變化，從而揭示代謝調(diào)控的分子基礎(chǔ)。

眾多疾病的發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)功能異常密切相關(guān)。CETSA技術(shù)可用于研究疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性變化以及與潛在治療靶點(diǎn)的相互作用。以神經(jīng)退行性疾病研究為例，科研人員通過(guò)分析患者細(xì)胞或動(dòng)物模型中與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，如tau蛋白、α - 突觸核蛋白等的熱穩(wěn)定性，來(lái)探討蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集的機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)性的治療藥物提供重要線索。

CETSA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

CETSA技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)之一在于無(wú)需對(duì)小分子化合物或蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，這就有效避免了標(biāo)記過(guò)程可能對(duì)生物分子結(jié)構(gòu)和功能造成的干擾，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠更加真實(shí)、準(zhǔn)確地反映蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用。

該技術(shù)能夠直接在細(xì)胞或組織勻漿中開展實(shí)驗(yàn)，很好地保留了細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和生理環(huán)境。與體外重組蛋白實(shí)驗(yàn)相比，具有更強(qiáng)的生理相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說(shuō)服力。

當(dāng)CETSA技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合時(shí)，可以同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)高通量篩選小分子化合物的潛在作用靶點(diǎn)。這有助于科研人員全面、系統(tǒng)地了解藥物作用的分子機(jī)制，加速藥物研發(fā)進(jìn)程。

CETSA技術(shù)作為一種創(chuàng)新型的化合物釣靶方法，在藥物研發(fā)和基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。它通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)與小分子化合物結(jié)合后的熱穩(wěn)定性變化，為研究蛋白質(zhì) - 小分子相互作用提供了一種簡(jiǎn)便且高效的手段。盡管當(dāng)前該技術(shù)仍面臨著一些挑戰(zhàn)，但隨著技術(shù)的持續(xù)改進(jìn)與完善，以及與其他先進(jìn)技術(shù)的深度融合發(fā)展，CETSA有望在未來(lái)的生命科學(xué)研究和醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，為新藥研發(fā)和疾病治療帶來(lái)全新的突破。