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CETSA技術(shù)在細(xì)胞與組織裂解液水平研究中的應(yīng)用與進(jìn)展

2025-02-08 點(diǎn)擊數(shù):0 分享至:

引言


在生命科學(xué)研究里,新技術(shù)不斷刷新我們對(duì)生物分子的認(rèn)知。細(xì)胞熱位移分析(CETSA)作為新興生物物理技術(shù),為蛋白質(zhì)研究開辟新路徑。傳統(tǒng)方法研究蛋白質(zhì) - 配體相互作用及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性時(shí),操作復(fù)雜、需特殊標(biāo)記,還會(huì)干擾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和細(xì)胞生理環(huán)境,導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性欠佳。CETSA技術(shù)利用蛋白質(zhì)受熱變性特性,在接近細(xì)胞生理狀態(tài)下監(jiān)測(cè)細(xì)胞或組織裂解液中蛋白質(zhì)狀態(tài),具有簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需標(biāo)記、不破壞生理環(huán)境的優(yōu)勢(shì),在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中備受青睞。


CETSA技術(shù)原理


(一)基本原理

CETSA技術(shù)基于蛋白質(zhì)對(duì)溫度變化的響應(yīng)。正常時(shí),蛋白質(zhì)靠獨(dú)特三維結(jié)構(gòu)維持溶解性和穩(wěn)定性以執(zhí)行功能。與配體結(jié)合后,內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性改變,影響熱穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)時(shí),將細(xì)胞或組織裂解液置于溫度梯度處理,用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)、質(zhì)譜(MS)分析蛋白質(zhì)溶解度或豐度變化,繪制熔解曲線。蛋白質(zhì)與配體結(jié)合會(huì)使熔解曲線位移,科研人員借此了解蛋白質(zhì) - 配體相互作用。


(二)技術(shù)流程

樣品制備:細(xì)胞水平研究收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,PBS洗滌后用物理或化學(xué)方法制備裂解液;組織水平研究將新鮮組織切碎,緩沖液勻漿后裂解。


溫度梯度處理:將裂解液均分,從37℃起以2 - 5℃間隔升溫至95℃左右,各溫度點(diǎn)孵育5 - 15分鐘。


蛋白質(zhì)分離與檢測(cè):孵育后冰浴冷卻,離心分離變性和未變性蛋白質(zhì)。WB技術(shù)通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)豐度;MS技術(shù)酶解蛋白質(zhì)成肽段,用液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定和定量。


CETSA技術(shù)在細(xì)胞水平的應(yīng)用


藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證:

藥物研發(fā)中鎖定靶點(diǎn)很關(guān)鍵,CETSA技術(shù)檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化,可驗(yàn)證潛在靶點(diǎn)。以抗癌藥研究為例,分析癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白質(zhì),熔解曲線有位移且符合預(yù)期機(jī)制的可能是靶點(diǎn),能在全細(xì)胞蛋白質(zhì)組篩選新靶點(diǎn)。


研究蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用:

細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程多依賴蛋白質(zhì)相互作用,CETSA技術(shù)通過(guò)比較單個(gè)和復(fù)合蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性判斷其相互作用及強(qiáng)弱,可用于研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。


監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理狀態(tài)變化:

細(xì)胞不同生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)組有變化,CETSA技術(shù)能捕捉這些變化。如細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí),檢測(cè)抗氧化蛋白質(zhì)熔解曲線可了解其應(yīng)激狀態(tài)。


CETSA技術(shù)在組織裂解液水平的應(yīng)用


疾病診斷與生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn):

臨床研究中,CETSA技術(shù)用于組織裂解液,對(duì)比正常和病變組織蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性差異,篩選生物標(biāo)志物,如腫瘤組織中熱穩(wěn)定性不同的蛋白質(zhì)可用于腫瘤診斷。


藥物療效評(píng)估:

分析藥物處理后的組織裂解液蛋白質(zhì)變化,可直觀反映藥物療效。如神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物研究,觀察腦組織裂解液中神經(jīng)功能相關(guān)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性,判斷藥物作用。


組織特異性蛋白質(zhì)研究:

不同組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜和功能不同,CETSA技術(shù)對(duì)比不同組織裂解液蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性,可發(fā)現(xiàn)特定組織高表達(dá)且熱穩(wěn)定性獨(dú)特的蛋白質(zhì),有助于揭示組織生物學(xué)特性。


CETSA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限性


優(yōu)勢(shì)

生理相關(guān)性:接近生理?xiàng)l件檢測(cè),還原蛋白質(zhì)狀態(tài)和相互作用,避免干擾,保證結(jié)果真實(shí)可靠。


無(wú)標(biāo)記檢測(cè):無(wú)需復(fù)雜標(biāo)記,減少步驟和干擾,降低成本,提高效率。


高通量潛力:與質(zhì)譜結(jié)合可一次分析大量蛋白質(zhì),實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組系統(tǒng)性研究。


CETSA技術(shù)在多領(lǐng)域已展現(xiàn)應(yīng)用前景,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和分析方法、克服局限性是其發(fā)展關(guān)鍵。隨著質(zhì)譜和生物信息學(xué)進(jìn)步,有望實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)蛋白質(zhì)組分析,與其他前沿技術(shù)結(jié)合也將拓展其應(yīng)用邊界。


研錦生物可以利用基于靶點(diǎn)或小分子結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法,對(duì)可購(gòu)買化合物、天然產(chǎn)物等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選,并獲得潛在活性的化合物列表供進(jìn)一步活性實(shí)驗(yàn)確證。面向制藥企業(yè)和科研院所,可提供一站式的早期藥物研發(fā)服務(wù),包括虛擬藥物篩選、先導(dǎo)優(yōu)化、靶標(biāo)預(yù)測(cè)、 動(dòng)力學(xué)模擬等,涉及小分子化學(xué)藥、生物藥、中藥等多種新藥類型,為您提供優(yōu)質(zhì)的藥物發(fā)現(xiàn)服務(wù)


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