藥物靶點篩選是現代藥物研發的核心環節，而有限蛋白水解-質譜聯用技術（LiP-MS） 憑借其無需探針修飾和原位捕捉蛋白構象變化的能力，已成為該領域的重要突破。以下從技術原理到前沿應用進行系統解析：

一、技術原理：蛋白構象穩定性的質譜解碼

當小分子藥物與靶蛋白結合時，會通過氫鍵等非共價作用穩定蛋白結構，使其對抗蛋白酶水解的能力顯著增強。LiP-MS利用這一特性，通過三步實現靶點篩選：

有限酶解：在生理條件下用廣譜蛋白酶（如蛋白酶K）處理藥物-蛋白復合物，未結合蛋白被高效切割，而結合蛋白因構象穩定得以“保護”。

差異肽段生成：藥物結合區域的蛋白酶切位點暴露減少，產生實驗組特有的完整肽段（如案例中油酸結合的ENO1蛋白的R47-R67肽段）。

質譜定量分析：通過高分辨質譜（如4D-DIA/Tims-TOF）檢測實驗組與對照組的肽段豐度差異，定位潛在靶點及結合域，分辨率可達12個氨基酸。

關鍵創新點：相較于傳統方法（如化學探針修飾），LiP-MS直接在生理環境下捕獲天然構象的蛋白-藥物相互作用，避免了因修飾導致的活性失真。

二、技術流程與核心優勢

實驗流程標準化

樣本制備：使用細胞裂解液或組織提取總蛋白（需避免變性劑）

藥物孵育：小分子與蛋白在生理緩沖體系中孵育（通常15分鐘-2小時）

兩步酶解：先經蛋白酶K有限水解，再用胰蛋白酶完全消化

質譜檢測：LC-MS/MS定量分析差異肽段（如4D-DIA可提升檢測深度）

技術優勢顯著：

無需修飾：直接使用原藥物分子，保留其天然活性

多維度數據：同時獲取蛋白豐度變化與構象變化信息

高分辨率：可精確定位到單個功能結構域（如金絲桃素結合Dlat蛋白的C末端結構域）

廣適用性：適用于變構調節、酶-底物復合物等多種作用類型

局限性：對蛋白序列覆蓋率要求較高（需>30%），且動態構象可能干擾位點識別。

三、應用場景：從靶點發現到機制解析

1. 藥物靶點發現

案例1-代謝物靶點：通過LiP-MS篩選出油酸結合靶點ENO1（烯醇化酶1）和異膽酸靶點FXR1，經SPR驗證結合力（KD=10.6μM/32.9μM）。

案例2-天然產物抗肥胖機制：鑒定出金絲桃素（HPF）直接結合二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶（Dlat），激活AMPK-PGC1α軸以促進脂肪褐變。

2. 結合位點分析

針對已知靶點（如純化重組蛋白），LiP-MS可解析藥物結合域。例如在衰老研究中，鎖定谷氨酸合成酶Glt1的聚合界面，突變該區域可恢復氨基酸穩態并延長壽命。

3. 多組學整合研究

結構-功能關聯：結合轉錄組/代謝組數據，揭示靶點調控網絡（如酵母衰老中Glt1聚合與線粒體功能障礙的關聯）。

脫靶效應篩查：高通量檢測非目標蛋白結合情況，評估藥物安全性。

四、方法學比較：LiP-MS vs DARTS

二者均為免標記靶點篩選技術，但存在顯著差異：

五、技術演進與未來方向

儀器創新：4D-質譜（timsTOF HT）提升檢測靈敏度與肽段覆蓋率

算法優化：分子對接模擬（如Autodock Vina）輔助驗證結合位點，降低假陽性

活體應用：開發體內LiP-MS（in vivo LiP），直接在動物模型中捕捉藥物-靶點互作

臨床轉化：整合疾病生物標志物篩選（如神經退行性疾病中淀粉樣蛋白構象變化）

如2021年《Cell》研究所述，LiP-MS已實現單細胞水平蛋白動態結構監測，為精準藥物設計提供新范式。

LiP-MS憑借其原位捕捉蛋白構象變化的能力，重塑了藥物靶點篩選的邏輯框架。隨著高分辨質譜與計算模擬的深度融合，該技術有望在變構藥物開發和多靶點系統藥理研究中釋放更大潛力，推動藥物研發從“經驗篩選”邁向“數據驅動”的新階段。

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