北大曾克武/屠鵬飛教授團隊在國際學(xué)術(shù)期刊Advanced Science上發(fā)表了題為“Allosteric Activation of Transglutaminase 2 via Inducing an ‘Open’ Conformation for Osteoblast Differentiation”的研究論文，本文基于點擊化學(xué)構(gòu)建毛喉素的小分子活性探針，從小鼠前成骨細胞MC3T3-E1中“釣”出其直接作用靶點谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2（TGM2），深入闡明了天然活性小分子化合物毛喉素（forskolin）治療骨質(zhì)疏松的分子靶點及作用機制。

研究背景

·成骨細胞在骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，其功能障礙可導(dǎo)致嚴重骨骼疾病。

·毛喉素（FSK）是傳統(tǒng)藥用植物毛喉鞘蕊花的代表性活性成分，具有一定的促成骨分化的作用，表明對其骨質(zhì)疏松癥等骨病具有潛在的治療作用

·谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2（TGM2）是一種多功能酶，有研究表明TGM2可以誘導(dǎo)成骨細胞分化并改善骨量減少和抑制破骨細胞數(shù)的增多，但尚未有研究報道候選藥物靶向TGM2促進成骨細胞分化和骨重建。

研究方法

·使用FSK作為化學(xué)探針，通過合成含有光親和標(biāo)簽和點擊化學(xué)手柄的FSK分子探針（AD-FSK）來識別細胞靶點。

·通過多種生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法（如SPR分析、LC-MS/MS、分子動力學(xué)模擬等）研究FSK與TGM2的相互作用。

其中鑒定FSK的直接作用靶點

基于點擊化學(xué)合成，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定FSK作用靶點，通過表面等離子體共振實驗、Pull-down實驗、CETSA實驗、DARTS實驗證明了毛喉素直接與MC2T3-E3細胞中的TGM2結(jié)合。

ABPP：

探針合成：研究人員合成了帶有光親和標(biāo)記和點擊化學(xué)手柄的FSK探針（AD-FSK），用于在細胞內(nèi)捕獲TGM2及其相互作用蛋白。

光親和標(biāo)記：將AD-FSK與MC3T3-E1細胞共同孵育后，通過UV照射誘導(dǎo)探針與靶蛋白形成共價鍵。

點擊化學(xué)反應(yīng)：利用點擊化學(xué)反應(yīng)將生物素-PEG-疊氮化物或5-TAMRA-疊氮化物連接到探針標(biāo)記的蛋白質(zhì)上。

親和純化與質(zhì)譜分析：通過鏈霉親和素磁珠富集標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析（LC-MS/MS），以鑒定與TGM2相互作用的蛋白質(zhì)。

SPR:

通過SPR分析，研究人員發(fā)現(xiàn)FSK能夠直接與TGM2結(jié)合，解離常數(shù)（Kd）為3.1 μM，表明FSK與TGM2之間存在中等強度的結(jié)合。

CETSA-WB

在CETSA實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)FSK處理后的MC3T3-E1細胞中，TGM2的熱穩(wěn)定性顯著增強，表明FSK與TGM2結(jié)合后改變了其構(gòu)象，使其更加穩(wěn)定。

總結(jié)：

·ABPP用于鑒定與TGM2相互作用的蛋白質(zhì)，揭示了TGM2在成骨細胞分化中可能涉及的分子機制和信號通路。

·SPR技術(shù)直接驗證了FSK與TGM2之間的結(jié)合，并測定了結(jié)合親和力。

·CETSA-WB技術(shù)通過評估TGM2的熱穩(wěn)定性變化，間接證明了FSK與TGM2的結(jié)合及其對TGM2構(gòu)象的影響。

這些技術(shù)的綜合應(yīng)用為深入理解TGM2在成骨細胞分化中的作用及其變構(gòu)激活機制提供了有力的實驗證據(jù)。

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