近日，國際藥理學(xué)期刊《Phytomedicine》（IF=7.9）發(fā)表了一項突破性研究《Sanguinarine suppresses oral squamous cell carcinoma progression by targeting the PKM2/TFEB axis to inhibit autophagic flux》。該研究由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院等七家單位聯(lián)合完成，首次揭示天然化合物血根堿（Sang）通過靶向PKM2蛋白抑制自噬流，從而阻斷口腔鱗癌（OSCC）進(jìn)展的全新機(jī)制。研究中的表面等離子共振（SPR）和有限蛋白酶解質(zhì)譜聯(lián)用（LIP-MS）技術(shù)成為鎖定藥物靶點(diǎn)的關(guān)鍵利器，為天然藥物靶點(diǎn)鑒定提供了教科書級范本。

研究背景與意義：天然藥物的靶點(diǎn)困局

口腔鱗癌（OSCC）占頭頸部腫瘤的40%，五年生存率不足50%。Sang作為罌粟科植物提取物，雖被證實具有顯著抗癌活性，但其作用靶點(diǎn)長期不明，制約了臨床轉(zhuǎn)化。傳統(tǒng)靶點(diǎn)篩選方法存在假陽性率高、無法區(qū)分直接/間接作用等局限，而本研究通過SPR與LIP-MS的聯(lián)用，首次精準(zhǔn)捕獲Sang的直接靶點(diǎn)——丙酮酸激酶（PKM2），為"老藥新用"提供機(jī)制基礎(chǔ)。

LIP-MS技術(shù)：從千種蛋白中鎖定真兇

【實驗設(shè)計】研究團(tuán)隊采用創(chuàng)新性LIP-MS技術(shù)：將CAL27細(xì)胞裂解液分為4組（對照組+3個Sang濃度組），加入蛋白酶K進(jìn)行有限酶解。藥物結(jié)合的靶蛋白因空間位阻抵抗酶切，導(dǎo)致其肽段豐度/序列區(qū)別于對照組。

【技術(shù)優(yōu)勢】與傳統(tǒng)方法相比，LIP-MS具備三大突破：

1）在天然細(xì)胞環(huán)境中捕獲靶點(diǎn)；

2）無需化學(xué)標(biāo)記避免結(jié)構(gòu)干擾；

3）可篩選未知結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白。

【關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)】質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析顯示，6個蛋白在Sang處理后顯著抗酶解，其中PKM2在三個濃度組均被富集，提示其為高親和力靶點(diǎn)。

SPR技術(shù)：毫秒級精準(zhǔn)量化藥物-靶標(biāo)互作

【實驗設(shè)計】為驗證LIP-MS結(jié)果，團(tuán)隊采用SPR技術(shù)：將PKM2蛋白固化于CM5芯片表面，使不同濃度Sang（0.625-10 μM）流過芯片，通過實時監(jiān)測折射率變化生成傳感圖譜。

【技術(shù)優(yōu)勢】SPR的實時檢測特性，可精準(zhǔn)獲取結(jié)合動力學(xué)參數(shù)：1）結(jié)合速率常數(shù)（k_a）；2）解離速率常數(shù)（k_d）；3）平衡解離常數(shù)（K_D）。

【關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)】傳感圖譜顯示典型"濃度依賴型"結(jié)合曲線，證實Sang與PKM2存在強(qiáng)效特異性結(jié)合。

雙技術(shù)聯(lián)用：多維驗證靶點(diǎn)可靠性

研究通過三重互證策略確保靶點(diǎn)真實性：

1.虛擬篩選交叉驗證：GalaxySagittarius算法預(yù)測PKM2為Sang潛在靶點(diǎn)（對接評分-24.713，排名第5）；

2.獨(dú)立技術(shù)佐證：MST（微量熱泳動）檢測到相同K_D值；

3.功能位點(diǎn)鎖定：分子對接發(fā)現(xiàn)Sang結(jié)合于PKM2的F26位點(diǎn)，突變該位點(diǎn)（F26A）后結(jié)合能力消失。

技術(shù)啟示：為何選擇SPR與LIP-MS？

本研究成功凸顯兩大核心技術(shù)的獨(dú)特價值：

LIP-MS優(yōu)勢：適用于復(fù)雜基質(zhì)中未知靶點(diǎn)的全局性篩選，避免傳統(tǒng)pull-down技術(shù)的假陽性問題；

SPR優(yōu)勢：提供實時動力學(xué)參數(shù)，適用于藥物-靶標(biāo)親和力精準(zhǔn)評價及先導(dǎo)化合物優(yōu)化；

聯(lián)用價值：LIP-MS廣撒網(wǎng)初篩靶點(diǎn) + SPR深驗證量化互作，形成靶點(diǎn)研究的"黃金閉環(huán)"。

Peng YC, He ZJ, Yin LC, et al. Sanguinarine suppresses oral squamous cell carcinoma progression by targeting the PKM2/TFEB aix to inhibit autophagic flux.Phytomedicine. 2025;136:156337. doi:10.1016/j.phymed.2024.156337

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